复旦大学：《生物化学》课程教学资源（实验讲稿）实验三 蛋白电泳

实验三:蛋白电泳

实验三：蛋白电泳

目的 ●掌握板状电泳分离血清蛋白的操作技术 ●熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

目的：  掌握板状电泳分离血清蛋白的操作技术  熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

电泳 带电粒子在电场的作用下,向着与其电 性相反的电极移动。 ●电泳技术一一利用电泳现象对混合物进 行分离分析的技术 °介质:聚丙烯酰胺凝胶 样品:血清蛋白

电泳  带电粒子在电场的作用下，向着与其电 性相反的电极移动。  电泳技术——利用电泳现象对混合物进 行分离分析的技术。  介质：聚丙烯酰胺凝胶  样品：血清蛋白

装置 垂直平板电泳槽的安装 ●把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净、 晾干 将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之 间留有空隙),两边用夹子夹住 将玻璃板卡在配胶架上 ●加双蒸水检验是否漏水

装置  垂直平板电泳槽的安装  把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净、 晾干  将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之 间留有空隙)，两边用夹子夹住  将玻璃板卡在配胶架上  加双蒸水检验是否漏水

凝胶制备 试剂分离胶(m)浓缩胶(m) 分离胶缓冲液125 单体交联剂 2.5 1.5 浓缩胶缓冲液 1.24 蒸馏水 6.15 16 催化剂(AP) 0.1 0.1 SDS 0.1 0.1 TEMED 0.008 0.006 总体积 10 10 丙烯酰胺浓度75 4.5

凝胶制备 试剂 分离胶（ml） 浓缩胶（ml） 分离胶缓冲液 1.25 － 单体交联剂 2.5 1.5 浓缩胶缓冲液 － 1.24 蒸馏水 6.15 7.16 催化剂(AP) 0.1 0.1 SDS 0.1 0.1 TEMED* 0.008 0.006 总体积 10 10 丙烯酰胺浓度 7.5 4.5

分离胶制备 ●用移液器吸取分离胶,沿壁加入垂直平 板中,直至胶液的高度达平板高度的 2/3左右 °上面再覆盖一层双蒸水 ●室温下静置约20min即可聚合

分离胶制备  用移液器吸取分离胶，沿壁加入垂直平 板中，直至胶液的高度达平板高度的 2/3左右  上面再覆盖一层双蒸水  室温下静置约20min即可聚合

制备时注意 °平板清洁 ●加完催化剂后充分混匀,再加 TEMED 再混匀 °保持液面水平 ●加水覆盖时缓慢匀速加入 丙烯酰胺、 TEMED有毒,避免直接接

制备时注意  平板清洁  加完催化剂后充分混匀，再加TEMED 再混匀  保持液面水平  加水覆盖时缓慢匀速加入  丙烯酰胺、TEMED有毒，避免直接接 触

电泳原理 带电粒子的迁移率 电场力F=XQ(X:电场强度,Q:电荷量) 阻力F=6n(r:半径,n:介质粘度) 当电泳颗粒匀速运动:F=F XQ=6TTrnv VEXQ/6TTrn V取决于Q、粒子大小r和形状 Q越多,V越大;r越小,Ⅴ越大;球形分子> 纤维状

电泳原理  带电粒子的迁移率  电场力F=XQ（X：电场强度， Q：电荷量）  阻力F =6πrηv（r：半径，η：介质粘度）  当电泳颗粒匀速运动: F=F  XQ=6πrηv  v=XQ/6πrη  V取决于Q、粒子大小r和形状  Q越多，V越大； r越小，V越大；球形分子> 纤维状

影响电泳速度的因素 °样品本身:电荷量、分子大小、形状 电场强度:电压 电泳介质的pH和离子强度

 影响电泳速度的因素：  样品本身：电荷量、分子大小、形状  电场强度：电压  电泳介质的pH和离子强度

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 PAGE lamide gelelectrophoresis ● polyacr ●丙烯酰胺单体 ●交联剂:N,N-亚甲基双丙烯酰胺 ●催化剂:过硫酸铵(AP) ●加速剂:四甲基乙二胺( TEMED)

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理  polyacrylamide gelelectrophoresis  PAGE  丙烯酰胺单体  交联剂：N, N’-亚甲基双丙烯酰胺  催化剂：过硫酸铵（AP）  加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）