《遗传与分子生物学实验》课程教学资源（讲义）DNA的纯化及鉴定

DNA的纯化及鉴定

DNA的纯化及鉴定

核酸的纯度与质量背景知识获得高质量核酸的重要性：DNA分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高纯度、高质量的DNA是非常重要的前提*核酸的纯化：根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染，并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品、核酸的鉴定：浓度、纯度、完整性

核酸的纯度与质量  获得高质量核酸的重要性：DNA分子生物学研究的 主要对象，为了进行测序、杂交和基因的表达，获 得高纯度、高质量的DNA是非常重要的前提。  核酸的纯化：根据所需核酸的性质和特点除去其它 核酸污染，并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机 溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。  核酸的鉴定：浓度、纯度、完整性 背景知识

核酸纯化应达到的要求背景知识核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染

核酸纯化应达到的要求  核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子；  其它生物大分子的污染应降低到最低程度；  排除其它核酸分子的污染。 背景知识

核酸的鉴定背景知识核酸浓度检测定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%，因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。·定糖法RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。紫外吸收法核酸紫外吸收峰位于260nm处，测定OD260值可以计算核酸浓度。A260=1时，样品中双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA（μg/μl）=A260×50×稀释倍数/1000RNA（μg/μl)=A260×40×稀释倍数/1000

核酸浓度检测  定磷法 DNA和RNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷 量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%，因此可从样品中测得的 含磷量来计算DNA或RNA的含量。  定糖法 RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对 DNA和RNA进行定量测定。  紫外吸收法 核酸紫外吸收峰位于260 nm处，测定OD260值可以计算核酸浓度。 A260 ＝1时，样品中双链DNA浓度为50 μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40 μg/ml。 DNA (μg/μl) = A260×50×稀释倍数/1000 RNA (μg/μl)= A260×40×稀释倍数 /1000 背景知识 核酸的鉴定

核酸的鉴定背景知识核酸纯度的检测核酸的纯度用A260/A280比值表示OD260 / OD280 = 1.8为DNA纯品OD260 / OD280 = 1.8~2.0-为RNA纯品

核酸纯度的检测  核酸的纯度用A260/A280比值表示。 OD260 / OD280 ＝1.8 ——为DNA纯品 OD260 / OD280 ＝1.8~2.0 ——为RNA纯品 背景知识 核酸的鉴定

核酸的鉴定背景知识核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带，其中28srRNA的亮度应为18srRNA的两倍，5srRNA较弱

核酸完整性检测  核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定 （RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色， 紫外灯观察。  凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总 RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条 带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。 背景知识 核酸的鉴定

DNA纯化基本原理实验原理苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂，可同时抑制DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是可使提取的DNA保持天然状态

实验原理 DNA纯化基本原理  苯酚抽提法  苯酚作为蛋白变性剂，可同时抑制DNase的降解作用。  用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋白分子 表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相， 而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并 含DNA 的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。  此法的特点是可使提取的DNA保持天然状态

实验原理紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构（共轭双键）在紫外光区具有较强的吸收，其吸收峰在260nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230计算其比值来衡量样品的纯度。心浓度的计算1 OD260 = 50 μg/mL dsDNA1 OD260 = 40 μg/mL ssDNA/RNA*纯度的计算DNA纯品的OD260/OD280约为1.8，OD260/OD230≥2.0OD260/OD280>1.8说明含有RNA污染；OD260/OD280<1.6说明有残余的蛋白质、酚等存在；OD260/OD230<2.0说明盐和小分子污染

紫外分光光度法—测定DNA的纯度和浓度 原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构（共轭双键）在紫外光区具有较强的 吸收，其吸收峰在260 nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分 子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280 nm处有最大的 吸收峰，盐和小分子则集中在230 nm处。因此，一般情况下同时检测同 一样品的OD260、OD280 和OD230计算其比值来衡量样品的纯度。 浓度的计算 1 OD260 = 50 μg/mL dsDNA 1 OD260 = 40 μg/mL ssDNA/RNA 纯度的计算 DNA纯品的OD260/OD280 约为1.8， OD260/OD230 ≥2.0 OD260/OD280＞1.8说明含有RNA污染； OD260/OD280＜1.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在； OD260/OD230＜2.0 说明盐和小分子污染。 实验原理

琼脂糖凝胶电泳法实验原理分离鉴定核酸的常规方法原理琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。带负电粒正极负极带正电粒子结果观察制备凝胶时先加入少量荧光染料（EB），其分子可插入双链DNA的碱基对之间，可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（红色荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照

实验原理 琼脂糖凝胶电泳法—分离鉴定核酸的常规方法 原理 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助 琼脂凝胶分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速 度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱 基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正 极迁移。 结果观察 制备凝胶时先加入少量荧光染料（EB），其分子可插入双链DNA的 碱基对之间，可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（红色 荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照

琼脂糖凝胶电泳（1）可分瓣的核酸分子的大小范围50 ~ 30.000 bp琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分瓣范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000~30.0000.7%800 ~12,0001.0%500~10,0001.2%400~7,0001.5%200 ~ 3,0002.0%50 ~2,000

(1) 可分辨的核酸分子的大小范围： 50 ～ 30,000 bp 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800 ～12,000 1.0% 500 ～10,000 1.2% 400 ～7,000 1.5% 200 ～3,000 2.0% 50 ～2,000 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶电泳