《遗传与分子生物学实验》课程教学资源（讲义）PCR技术

实验七技术PCR

实验七 PCR 技术 1

技术概论PCR2

PCR 技术概论 2

Polymerase chain reaction聚合酶链式反应，PCR)口PCR是1980年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是分子生物学技术上的一项革命性创举口具有特异、灵敏、高效、简便、快速、易重复和自动化等优点。可在一个试管内将目的基因或特定DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。3

 PCR是1980年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，是 分子生物学技术上的一项革命性创举。 Polymerase chain reaction (聚合酶链式反应, PCR)  具有特异、灵敏、高效、简便、快速、易 重复和自动化等优点。可在一个试管内将目 的基因或特定DNA片段于数小时内扩增至十 万乃至百万倍。可从一根毛发、一滴血、甚 至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究 和检测鉴定。 3

PCR技术的发明由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明1993年获诺贝尔化学奖

由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明 PCR技术的发明 1993年获诺贝尔化学奖 4

PCR技术的发明1972穆利斯在美国加州大学伯克利分校获生物化学博士学位1979进入Cetus（西特斯）生物技术公司，负责合成赛核苷酸1983.3-4在与女友度假路上想到PCR原理的原型，随后确证此前无人做过1983.8在Cetus公司首次报告实验设计原理，但几乎无人相信1983.9以人DNA作为模板进行了编号为PCRO1的首个PCR实验，但失败1984.2-4自己认为成功扩增了人beta珠蛋白基因片段1984.6Cetus公司正式成立穆利斯领导的PCR组1984.11.15PCR实验确认获得成功1985.3申请有关PCR的第一个专利1986.2-4首次提出应用耐高温DNA聚合酶的想法1986.6TagDNA聚合酶应用成功，效果出色，PCR技术完全成功1986.9离开Cetus公司，获1万美元奖金，PCR专利权归Cetus公司1993.10.13创获诺贝尔化学奖5

PCR技术的发明 1972 穆利斯在美国加州大学伯克利分校获生物化学博士学位 1979 进入Cetus（西特斯）生物技术公司，负责合成寡核苷酸 1983.3 - 4 在与女友度假路上想到PCR原理的原型，随后确证此前无人做过 1983.8 在Cetus公司首次报告实验设计原理，但几乎无人相信 1983.9 以人DNA作为模板进行了编号为PCR01的首个PCR实验，但失败 1984.2-4 自己认为成功扩增了人beta珠蛋白基因片段 1984.6 Cetus公司正式成立穆利斯领导的PCR组 1984.11.15 PCR实验确认获得成功 1985.3 申请有关PCR的第一个专利 1986.2 - 4 首次提出应用耐高温DNA聚合酶的想法 1986.6 Taq DNA聚合酶应用成功，效果出色，PCR技术完全成功 1986.9 离开Cetus公司，获1万美元奖金，PCR专利权归Cetus公司 1993.10.13 获诺贝尔化学奖 5

PCR技术基本原理与DNA的天然复制过程类似。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合：③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，可获得更多的新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目6的基因扩增放大几百万倍

PCR技术基本原理 与DNA的天然复制过程类似。 PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用 下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性-退火-延伸三过程，可获得更多的新链又可成为下 次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。 6

PCR的扩增原理5模板DNA加热变性，双链解离为单链引物与模板DNA互补序列区特异匹配结合（退火/复性）在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链100DNAdenaturation9080Primerextension706050Primerannealinc40302010Cycletime

PCR的扩增原理 模板DNA加热变性，双链解离为单链 引物与模板DNA互补序列区特异匹配结合 （退火/复性） 在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与 半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链 7

PCR的循环扩增原理ReactionmixturecontainstargetTargetDNADNAsequence,2primers (P1,P2)and heat-stableTaq polymeraseP1TaqP2Reactionmixtureisheatedto95°C todenature targetDNA.SebsequentcoolingLtolowertemperature(60°C)allowsprimerstohybridizetothetargetDNATWhenheatedto72oC.Tagpolymeraseextendscomplementarystrandsfromprimers1stPCRcycleresultsin2copiesoftargetDNAsequence米国DNA denaturing&#PrimerannealingDNAExtentsion2ndPCRcycleresultsin4copiesoftargetDNAsequence8

PCR的循环扩增原理 8

CYCLENUMBERDNAcopynumber012345671DNA的理论拷贝数=2N241.8E+098161.6E+09321.4E+09641.2E+09JeqnuKdonvNG12881.0E+0925695128.0E+08101,0246.0E+08112,048124.0E+084,096138,1922.0E+081416,3840.0E+00A1532,768525010152030351665,536PCRcycle17131,0721018262,144919524,288222881,048,57612,097,152(Bol)eqnuKdo4,194,304632288,388,608516,777,216433,554,4323:2667,108,864227134,217,728128268,435,456029536,870,91252025010153035301,073,741,824PCR cycle311,400,000,000321,500,000,0009PCR试剂是限制因素！331,550,000,000341,580,000,000

CYCLE NUMBER DNA copy number 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 PCR试剂是限制因素! DNA的理论拷贝数=2N 0.0E+00 2.0E+08 4.0E+08 6.0E+08 8.0E+08 1.0E+09 1.2E+09 1.4E+09 1.6E+09 1.8E+09 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle DNA copy number 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle DNA copy number (log) 9

PCR的反应动力学特征PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。由于PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素的存在，大多数情况下，平台期是不可避免。10

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称 平台期。 由于PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性及非特异性 产物的竞争等因素的存在，大多数情况下，平台期是不可避 免。 PCR的反应动力学特征 10