齐齐哈尔大学：《植物生理学》课程教学资源（实验指导）实验 7 叶绿体色素的提取、分离和理化性质

实验 7 叶绿体色素的提取、分离和理化性质 一、原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素 a 、叶绿素 b 、胡 萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水， 而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。 因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定 相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分 开。 当叶绿素分子吸收光量子而转变成激发态时，分子很不稳定，当它变回到基态时发射出红光量 子，称为萤光现象。叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，因而可与 碱起皂化作用，产生的盐可溶于水中，利用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。 叶绿素分子中的镁可被 H + 所取代而形成褐色的去镁叶绿素。后者遇铜则形成绿色的铜代叶 绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做标本；叶绿素分子的化学性质也很不稳定， 易受强光破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 新鲜植物叶片。 （二）试剂 • 95 ％乙醇（或丙酮）。 • 碳酸钙。 • 石英砂。 • 汽油（纯净无色的）。 • 苯。 • 醋酸铜粉末。 • 50 ％醋酸。 • 氢氧化钾甲醇溶液： 20g 氢氧化钾用 100 mL 甲醇溶解，盛在具塞的试剂瓶中。 • 醋酸铜–醋酸溶液：用 50 ％醋酸 100 mL 溶入醋酸铜 6 g ，用时加蒸馏水 4 倍稀释。 （三）仪器设备 天平，剪刀，研钵，漏斗，培养皿一套（底和盖直径相同），蒸发皿，滤纸条（ 2 cm × 5 cm 左右），圆形滤纸，蒸发皿，电热吹风机，小烧杯，试管，酒精灯，铁三角架，石棉网，移液 管，滴管，玻棒。 三、实验步骤 1. 叶绿体色素的提取和荧光现象的观察 称取菠菜或其他植物新鲜叶片 2 ～ 3 g ，去掉中脉 剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂及碳酸钙粉，加 5 mL 95 ％乙醇，研磨成匀浆，再加 5 mL

实验 7 叶绿体色素的提取、分离和理化性质 一、原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素 a 、叶绿素 b 、胡 萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水， 而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。 因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定 相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分 开。 当叶绿素分子吸收光量子而转变成激发态时，分子很不稳定，当它变回到基态时发射出红光量 子，称为萤光现象。叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，因而可与 碱起皂化作用，产生的盐可溶于水中，利用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。 叶绿素分子中的镁可被 H + 所取代而形成褐色的去镁叶绿素。后者遇铜则形成绿色的铜代叶 绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做标本；叶绿素分子的化学性质也很不稳定， 易受强光破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 新鲜植物叶片。 （二）试剂 • 95 ％乙醇（或丙酮）。 • 碳酸钙。 • 石英砂。 • 汽油（纯净无色的）。 • 苯。 • 醋酸铜粉末。 • 50 ％醋酸。 • 氢氧化钾甲醇溶液： 20g 氢氧化钾用 100 mL 甲醇溶解，盛在具塞的试剂瓶中。 • 醋酸铜–醋酸溶液：用 50 ％醋酸 100 mL 溶入醋酸铜 6 g ，用时加蒸馏水 4 倍稀释。 （三）仪器设备 天平，剪刀，研钵，漏斗，培养皿一套（底和盖直径相同），蒸发皿，滤纸条（ 2 cm × 5 cm 左右），圆形滤纸，蒸发皿，电热吹风机，小烧杯，试管，酒精灯，铁三角架，石棉网，移液 管，滴管，玻棒。 三、实验步骤 1. 叶绿体色素的提取和荧光现象的观察 称取菠菜或其他植物新鲜叶片 2 ～ 3 g ，去掉中脉 剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂及碳酸钙粉，加 5 mL 95 ％乙醇，研磨成匀浆，再加 5 mL

95 ％乙醇，提取 3 ～ 5 min ，过滤于试管中，再用 3 mL 95 ％乙醇冲洗残渣。对浓的叶绿 体色素提取液观察透射光和反射光的颜色，解释其原因。 2. 叶绿体色素的分离 （ 1 ）取一张圆形滤纸（最好用色层析滤纸剪成圆形）。在滤纸的圆心戳一圆形小孔，另取 一张滤纸条（ 2cm × 5cm 左右，纸条的宽度主要根据培养皿的高度确定）。用滴管吸取浓叶 绿素提取液滴在纸条的一边，使色素扩展的宽度限制在 0.5 cm 以内，用电热吹风机吹干后， 再重复操作数次，然后将纸沿着长度的方向卷成纸捻，这样浸过叶绿体色素的一边恰在纸捻的 一端。 （ 2 ）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，与滤纸刚刚平齐（勿突出）。 （ 3 ）在培养皿中放蒸发皿，蒸发皿内加入适量汽油和 2 ～ 3 滴苯，将插有纸捻的圆形滤 纸平放在培养皿上，使滤纸的下端（无色素的一端）浸入汽油中，迅速用同一直径的培养皿盖 上。此时，叶绿体色素在推动剂的推动下沿着滤纸向四周移动，不久即可看到被分离的各种色 素的同心圆环。 （ 4 ）待汽油将要到达滤纸边缘时，取出滤纸，待汽油挥发后，用铅笔标出各种色素的位置 和名称。 3. 叶绿体色素的其他理化性质 将本实验步骤 1 中提取的叶绿体色素溶液用 95 ％乙醇稀释一倍，进行以下实验： （ 1 ）皂化作用（叶绿素与类胡萝卜素的分离） 用移液管吸取叶绿体色素提取液 5 mL 于试管中，加入 1.5 mL 20 ％氢氧化钾甲醇溶液，充 分摇匀。片刻后，加入 5 mL 苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入 1.5 mL 蒸馏水，轻轻混匀（不 要激烈摇荡），静置在试管架上，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀乙醇的溶液，其中溶有 皂化叶绿素 a 和 b, 上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素和叶黄素。 （ 2 ） H + 和 Cu 2+ 对叶绿素分子中 Mg 2+ 的取代作用 ① 取 2 支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液 2 mL ，作为对照。第二支试管中加叶绿体 色素提取液 5 mL ，再加入数滴 50 ％醋酸，摇匀，观察溶液的颜色变化。 ② 当溶液变褐色后，倒出一半于另一试管中，加入醋酸酮粉末少许，于酒精灯上微微加热， 观察溶液的颜色变化，与未加醋酸铜的一半相比较。 ③ 另取醋酸铜溶液 20 mL 左右，加入于烧杯中。取新鲜植物叶片 2 片，放入溶液中，用酒 精灯缓缓加热，观察并记录叶片的颜色变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。 （ 2 ）光对叶绿素的破坏作用 ① 取 4 支小试管，其中两支各加入 5 mL 用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入 2.5 mL 叶 绿体色素乙醇提取液，并用 95 ％乙醇稀释 1 倍。 ② 取 1 支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和 1 支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射 光下，另外两支放到暗处， 40 min 后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 ③ 另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光 下，另一半放在暗中，半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化

95 ％乙醇，提取 3 ～ 5 min ，过滤于试管中，再用 3 mL 95 ％乙醇冲洗残渣。对浓的叶绿 体色素提取液观察透射光和反射光的颜色，解释其原因。 2. 叶绿体色素的分离 （ 1 ）取一张圆形滤纸（最好用色层析滤纸剪成圆形）。在滤纸的圆心戳一圆形小孔，另取 一张滤纸条（ 2cm × 5cm 左右，纸条的宽度主要根据培养皿的高度确定）。用滴管吸取浓叶 绿素提取液滴在纸条的一边，使色素扩展的宽度限制在 0.5 cm 以内，用电热吹风机吹干后， 再重复操作数次，然后将纸沿着长度的方向卷成纸捻，这样浸过叶绿体色素的一边恰在纸捻的 一端。 （ 2 ）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，与滤纸刚刚平齐（勿突出）。 （ 3 ）在培养皿中放蒸发皿，蒸发皿内加入适量汽油和 2 ～ 3 滴苯，将插有纸捻的圆形滤 纸平放在培养皿上，使滤纸的下端（无色素的一端）浸入汽油中，迅速用同一直径的培养皿盖 上。此时，叶绿体色素在推动剂的推动下沿着滤纸向四周移动，不久即可看到被分离的各种色 素的同心圆环。 （ 4 ）待汽油将要到达滤纸边缘时，取出滤纸，待汽油挥发后，用铅笔标出各种色素的位置 和名称。 3. 叶绿体色素的其他理化性质 将本实验步骤 1 中提取的叶绿体色素溶液用 95 ％乙醇稀释一倍，进行以下实验： （ 1 ）皂化作用（叶绿素与类胡萝卜素的分离） 用移液管吸取叶绿体色素提取液 5 mL 于试管中，加入 1.5 mL 20 ％氢氧化钾甲醇溶液，充 分摇匀。片刻后，加入 5 mL 苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入 1.5 mL 蒸馏水，轻轻混匀（不 要激烈摇荡），静置在试管架上，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀乙醇的溶液，其中溶有 皂化叶绿素 a 和 b, 上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素和叶黄素。 （ 2 ） H + 和 Cu 2+ 对叶绿素分子中 Mg 2+ 的取代作用 ① 取 2 支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液 2 mL ，作为对照。第二支试管中加叶绿体 色素提取液 5 mL ，再加入数滴 50 ％醋酸，摇匀，观察溶液的颜色变化。 ② 当溶液变褐色后，倒出一半于另一试管中，加入醋酸酮粉末少许，于酒精灯上微微加热， 观察溶液的颜色变化，与未加醋酸铜的一半相比较。 ③ 另取醋酸铜溶液 20 mL 左右，加入于烧杯中。取新鲜植物叶片 2 片，放入溶液中，用酒 精灯缓缓加热，观察并记录叶片的颜色变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。 （ 2 ）光对叶绿素的破坏作用 ① 取 4 支小试管，其中两支各加入 5 mL 用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入 2.5 mL 叶 绿体色素乙醇提取液，并用 95 ％乙醇稀释 1 倍。 ② 取 1 支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和 1 支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射 光下，另外两支放到暗处， 40 min 后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 ③ 另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光 下，另一半放在暗中，半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化