齐齐哈尔大学：《植物生理学》课程教学资源（实验指导）实验 20 植物体内游离脯氨酸含量的测定

实验 20 植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、原理 当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水 分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。 用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂 呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。此法有专一性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物叶片。 （二）试剂 • 80% 乙醇。 • 人造沸石。 • 活性炭。 4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃） 溶解。试剂至少在 24 小时内稳定。 5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ， 其浓度为 100 μg/mL 。再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成 10 μg/mL 的脯 氨酸标准液。 （三）仪器设备 分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒 温水浴 三、实验步骤 1 ．绘制标准曲线 吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为 0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、 20.0 μg 。分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。用分光光度计 于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标作标准曲线。 2. 植株样品液的提取 选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成 浆状。用 80 % 乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中。 80 % 乙醇总量为 10 mL 。加盖 置于黑暗中室温下提取 24 h ，或 80 ℃恒温水浴中提取 20 min 。 将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。将滤 液置于试 管中，加其重量 1/5 的人造沸石强烈振荡 5 min 。将上层液在离心机上离心 10 min ，上清 液备用。 3. 样品溶液的测定 取 2 mL 上清液置于试管中，再加入 2 mL 冰醋酸和 2 mL 茚三酮试剂， 加盖密封，在沸水浴上加热 15 min 。用 3 mL 80% 乙醇代替样品液作为对照。在分光光度计 上测 515 nm 处各样品的吸光度，从标准曲线上求出样品溶液中脯氨酸含量。 四、结果计算 样品中脯氨酸含量的计算： 脯氨酸含量（ μg/g ） = 式中： C ——由标准曲线上查得的脯氨酸的质量， μg 。 V T ——提取液总体积， mL 。 V 1 ——测定液体积， mL

实验 20 植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、原理 当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水 分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。 用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、 谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂 呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。此法有专一性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 植物叶片。 （二）试剂 • 80% 乙醇。 • 人造沸石。 • 活性炭。 4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃） 溶解。试剂至少在 24 小时内稳定。 5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ， 其浓度为 100 μg/mL 。再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成 10 μg/mL 的脯 氨酸标准液。 （三）仪器设备 分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒 温水浴 三、实验步骤 1 ．绘制标准曲线 吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为 0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、 20.0 μg 。分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。用分光光度计 于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标作标准曲线。 2. 植株样品液的提取 选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成 浆状。用 80 % 乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中。 80 % 乙醇总量为 10 mL 。加盖 置于黑暗中室温下提取 24 h ，或 80 ℃恒温水浴中提取 20 min 。 将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。将滤 液置于试 管中，加其重量 1/5 的人造沸石强烈振荡 5 min 。将上层液在离心机上离心 10 min ，上清 液备用。 3. 样品溶液的测定 取 2 mL 上清液置于试管中，再加入 2 mL 冰醋酸和 2 mL 茚三酮试剂， 加盖密封，在沸水浴上加热 15 min 。用 3 mL 80% 乙醇代替样品液作为对照。在分光光度计 上测 515 nm 处各样品的吸光度，从标准曲线上求出样品溶液中脯氨酸含量。 四、结果计算 样品中脯氨酸含量的计算： 脯氨酸含量（ μg/g ） = 式中： C ——由标准曲线上查得的脯氨酸的质量， μg 。 V T ——提取液总体积， mL 。 V 1 ——测定液体积， mL

W ——样品质量， g 。 [ 思考题 ] 植物体内游离脯氨酸测定有何意义？

W ——样品质量， g 。 [ 思考题 ] 植物体内游离脯氨酸测定有何意义？