《植物作物育种学实验》课程教学课件（讲稿）小麦谷蛋白提取和凝胶电泳

实验一小麦高分子量谷蛋白亚基测定2023-12-21

2023-12-21 1 实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基测定

实验内容：测定小麦高分子量谷蛋白亚基实验目的：①学握利用不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电源(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)方法;②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱2023-12-21

2023-12-21 2 ● 实验内容： 测定小麦高分子量谷蛋白亚基 ●实验目的: ①掌握利用不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷 蛋白 亚基（HMW-GS）方法； ②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法； ③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱

小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)与小麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目前分离小麦HMW-GS的主要方法，此方法具有准确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤其是可以分析半粒无胚籽粒的HMW-GS组成，所剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选的重要方法

小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小 麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的 一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有 助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目 前分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有准 确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤 其是可以分析半粒无胚籽粒的 HMW-GS 组成，所 剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方 法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选 的重要方法

实验原理：小麦高分子量谷蛋白亚基不连续SDS-PAGE统集电荷效应、分子筛效应和浓缩数应为一体，在这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分子量大小分离开来。以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就可以对待测小麦品种的HMW-GS组成进行鉴定。2023-12-21

2023-12-21 4 ●实验原理： 小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 系 统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在 这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分 子量大小分离开来。 以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就 可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定

①电荷效应心各种蛋白质按其所带电荐的种类及数量，在电场向一定电极，以一定的速度泳动。迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量X的大小以及分子的形状等因素

v ①电荷效应 v 各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在 电场向一定电极，以一定的速度泳动。 v 迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量 的大小以及分子的形状等因素

②分子筛效应由于炭胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别不同大小分子种类的能力就是炭胶所具有的一种筛分能力即分子筛数应。③浓缩效应蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。2023-12-21

2023-12-21 6 ②分子筛效应 由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网 络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别 不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛 分能力即分子筛效应。 ③浓缩效应 蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成 层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩

实验材料、药品和器材实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,N,-四甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸甘油、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝等

● 实验材料、药品和器材 实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照 实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像 仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。 实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,N,-四 甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、 甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等

试剂配制：①麦谷蛋白提取液：4g SDS +1g DTT +250 ml0.5MTris-HCI (PH = 6.8)+ 20 ml甘 油 +30 mg澳酚蓝+ 蒸馏水定溶至 100 ml。10×电极缓冲液：Tris-HCI30.3 g + 甘氨酸 144 g+SDS10g+蒸馏水定溶至1000ml。③30%丙烯酰胺： 30 g+ 蒸馏水定溶至 100ml④2%甲叉双丙烯酰胺：2g+蒸馏水定溶至100ml

试剂配制： ①麦谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油 + 30 mg溴酚蓝 + 蒸馏水定溶至 100 ml。 ②10×电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸馏水定溶至 1000ml。 ③30%丙烯酰胺：30 g + 蒸馏水定溶至 100ml。 ④2%甲叉双丙烯酰胺：2 g + 蒸馏水定溶至 100ml

?) 1 M Tris-HCI （ PH = 6.8） : 12.1g Tris + 蒸馏水定溶 至 100ml,用 1 N HCI 调 PH = 6.8。③3 M Tris-HCI （ PH = 8.8） : 36.3g Tris + 蒸 馅水定溶至 100ml,用 1 M HCI 调 PH = 8.8。10%SDS：SDS10g+蒸馏水定溶至100ml710% 过硫酸铵： 1g过硫酸铵+ 蒸馏水定溶10ml。染色液：100mg G-250 +12 g三氟乙酸+ 蒸馏水定溶至200ml

⑤ 1 M Tris-HCI（ PH = 6.8）: 12.1g Tris + 蒸馏水定 溶至 100ml,用1 N HCI 调 PH = 6.8。 ⑥ 3 M Tris-HCI（ PH = 8.8）: 36.3g Tris + 蒸 馏水 定溶至 100ml,用1 M HCI 调 PH = 8.8。 ⑦ 10% SDS：SDS 10g + 蒸馏水定溶至100ml。 ⑧ 10% 过硫酸铵：1g过硫酸铵 + 蒸馏水定溶10ml。 ⑨ 染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸 + 蒸馏水定 溶至200ml

实验操作步骤1、小麦谷蛋白提取程序①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振葛器上混合均匀；②将离心管放入65°C水浴锅中水浴45min后取出离心管放，室温冷却；③将冷却后的离心管12000转/min离心30min保存于4℃冰箱备用

● 实验操作步骤 1、小麦谷蛋白提取程序 ①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中， 加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器 上混合均匀； ②将离心管放入65℃水浴锅中水浴45min后取 出离心管放，室温冷却； ③将冷却后的离心管12000转/min离心30min， 保存于 4℃ 冰箱备用