中国农业大学：《发酵工程》课程教学资源（讲义）实验三 发酵过程动力学实验

实验三发酵过程动力学实验 实验老师准备： 1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子） 2、产酶培养基确定（实验老师准备15瓶100ml产酶培养基和200ml已经长好 的种子)，培养基的组成按上次实验配方设计。 一，实验目的 学习生物反应过程的参数测定和计算方法 二.仪器 摇床（最大转速250rmin),紫外分光光度计、电热恒温水浴槽、烘箱 电子天平（感量0.001g) 三.试剂 1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸(DNS)和262mL2 mol/LNaOH溶液 加到酒石酸钾钠的热溶液中(192g酒石酸钾钠溶于500mL水中)，再加5g重蒸酚 和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL,保存于棕色瓶中放 置7天后使用。 2、测定蛋白酶活试剂同上次实验。 三.实验方法 1、生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用直接称重法。将发 酵液取出，在两层纱布上过滤菌体，自来水冲洗2-3次，收集菌体，在布氏漏斗 上抽干后称温重。 2、还原糖的测定 21原理 在碱性条件下，还原糖与3、5一二硝基水杨酸共热，3、5一二硝基水杨酸被 还原为3一氨基一5一硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它 物质。在一定范制内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关 系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计 算，可求出发酵液中还原糖的含量。 2.2实验步骤 (1)发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2m1稀释至含糖量2-8mg/100ml为试样

实验三 发酵过程动力学实验 实验老师准备： 1、种子培养基（实验老师准备 4 个 100ml 种子） 2、产酶培养基确定（实验老师准备 15 瓶 100ml 产酶培养基和 200ml 已经长好 的种子），培养基的组成按上次实验配方设计。 一．实验目的 学习生物反应过程的参数测定和计算方法 二．仪器 摇床（最大转速250r/min），紫外分光光度计、电热恒温水浴槽、烘箱 电子天平（感量0.001g） 三．试剂 1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液 加到酒石酸钾钠的热溶液中（192g酒石酸钾钠溶于500 mL水中），再加5g重蒸酚 和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放 置7天后使用。 2、测定蛋白酶活试剂同上次实验。 三．实验方法 1、生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用直接称重法。将发 酵液取出，在两层纱布上过滤菌体，自来水冲洗2-3次，收集菌体，在布氏漏斗 上抽干后称温重。 2、还原糖的测定 2.1原理 在碱性条件下，还原糖与3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水杨酸被 还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它 物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关 系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计 算，可求出发酵液中还原糖的含量。 2.2实验步骤 （1） 发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2ml稀释至含糖量2-8mg/100ml为试样

(2)取4支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂(1) 管号 空白 还原糖 项目 0 2 3 样品量 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 3.5 1.5 1.5 1.5 3、5-二硝基 1.5 1.5 1.5 1.6 水杨酸试剂 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后，将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷 水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水20.0ml,用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。 切勿用力振摇，引入气泡。在540m波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测 定出各管溶液的吸光度值。 (3)以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克 数，按下式计算样品中还原糖的百分含量： 还原糖%=标准曲线上查得的还原糖毫克数× 样品毫克数 3.发酵液中蛋白酶活的测定（同上次实验） 4、发酵液中pH测定：酸度计法。 四、实验具体操作 实验分组：每班分成六组，分别在以下时间进行取样，每组取两瓶。具体时 间为：在发酵0小时（前1天晚8点），12小时（第二天8点），15小时(11点)，18 小时（下午2点），21小时（下午5点），24小时（下午8点）分别测定发酵液中还 原糖含量，生物量，蛋白酶活，pH变化，将整个班级结果汇总在一张表上，并 标注自己组的各指标位置，以观察整体发酵水平及测定的准确性

（2）取4支干燥试管,编号,按下表所示的量,精确加入待测液和试剂(ml): 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 3.5 1.5 1.5 1.5 3、5－二硝基 水杨酸试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 加完试剂后, 将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷 水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。 切勿用力振摇，引入气泡。在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测 定出各管溶液的吸光度值。 （3）以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克 数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：  提取液总体积 标准曲线上查得的还原糖毫克数 测定时取用体积 样品毫克数 3.发酵液中蛋白酶活的测定（同上次实验） 4、发酵液中pH测定：酸度计法。 四、实验具体操作 实验分组：每班分成六组，分别在以下时间进行取样，每组取两瓶。具体时 间为：在发酵0小时（前1天晚8点），12小时（第二天8点），15小时（11点），18 小时（下午2点），21小时（下午5点），24小时（下午8点）分别测定发酵液中还 原糖含量，生物量，蛋白酶活，pH变化，将整个班级结果汇总在一张表上，并 标注自己组的各指标位置，以观察整体发酵水平及测定的准确性。 还原糖％＝