《土壤理化分析》课程教学资源（讲义）土壤酶活性测定

土壤酶活性测定 几种水解酶:芳基硫酸酯藤( Arylsulphatase(EC31.61),葡萄糖苷酶 - glucosidase(EC32121))和磷酸单酯酶( phosphomonoesterase(EC31.3)测定: 这三种酶的测定都是依据人工合成底物( p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate, respectively)裂解后释放的 p-nitrophenol的量来测定 Arylsulphatase(EC3.6.1):称取1g土(湿重),与4ml500mM乙酸缓冲液( acetate buffer (pH5.8)和lml底物(25mM)混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加lml灭菌蒸馏水。土壤稍 作涡旋振荡,置于旋转摇床20℃,20opm培养2h。然后,往样品中加lm无菌蒸馏水, 往对照中加1ml底物。再加入1ml500mM氯化钙和4ml500mM氢氧化钠以终止反应。悬 浮液在旋转摇床上20℃,200rpm振荡30min。9464×g离心5min,然后在400nm波长下 测定上清夜中所提取的 p-nitrophenol的颜色深度。如果是在中性条件下测定,则用蒸馏水 取代乙酸缓冲液。标准曲线制作:用蒸馏水配制 p-nitrophenol溶液,浓度范围0-s0ug/ml B- glucosidase((EC32.1.21):缓冲液换为改进的通用缓冲液( modified universal buffer (pH60)底物浓度25mM,提取液用Tris缓冲液(pH2.0) phosphomonoesterase(EC3.1.3):缓冲液换为改进的通用缓冲液( modified universal buffer) (pH40和90)(分别测定酸性和碱性磷酸酯酶),底物浓度为15mM。 脲藤 Urease(EC3.5.1.5) 称取5g土(湿土),加25ml脲(80mM)和20ml75mM硼酸缓冲液(pH10.0)。涡 旋振荡,旋转摇床20℃,20orpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓 冲液。4h后,处理中加2。5n灭菌蒸馏水,对照中加2。5m脲。然后用30ml酸化的2M 氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃,200rpm振荡3min。9464×g离心5min,取lm上 清夜与9ml蒸馏水、5ml水杨酸钠( sodium salicylate)/氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na盐)混允,202℃静置1h,在690n波长下测定溶液的颜色强 度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作,浓度范围 0-2.5ug/m1。 脱氢( Dehydrogenase) iNT(2(p-iodopheny 1)-3-(p-nitropheny 1)-5-phenyl tetrazolium chloride)isEE 活性(既脱氢酶活性)采用 Von mers i和 Schinner(1991)的方法测定。lg鲜土置于带盖 的玻璃瓶中,加入1.5m11 M Tris缓冲液(p7.0)和2 mI INt(5mg/m1,溶于2%体积比的 二甲替甲酰胺(N,N- dimethy formamide)中)。对照土壤加1.5 ml Tris缓冲液和2ml蒸 馏水。旋转摇床20℃,20orpm培养24h。然后,往样品中加2m蒸馏水,而往对照土样中 加2mINT。然后加10mN,N- dimethy formamide/甲醇(1:1,w/v)提取液终止反应 20℃,200rpm振荡Ih。9464×g离心5min,464m波长下测定上清夜的吸光值。对于中性 土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF( iodonitrotetrazolium chloride)( Sigma)制作标 准曲线,浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解( Fluorescein diacetate hydrolysis) 称取3g鲜土,悬浮于50ml磷酸盐缓冲液,加入250uFDA(2mgml,溶于丙酮)。对照 加25oul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃,20orpm培养4h。培养结束后,样品中加250ud蒸馏

土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（ Arylsulphatase(EC 3.1.6.1) ） , 葡萄糖苷酶 （β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定： 这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的 p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取 1g 土（湿重），与 4ml 500mM 乙酸缓冲液（acetate buffer） （pH5.8）和 1ml 底物（25mM）混匀。对照为 4ml 乙酸缓冲液加 1ml 灭菌蒸馏水。土壤稍 作涡旋振荡，置于旋转摇床 20℃，200rpm 培养 2h。 然后，往样品中加 1ml 无菌蒸馏水， 往对照中加 1ml 底物。再加入 1ml 500mM 氯化钙和 4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬 浮液在旋转摇床上 20℃，200rpm 振荡 30min。9464×g 离心 5min， 然后在 400nm 波长下 测定上清夜中所提取的 p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水 取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制 p-nitrophenol 溶液，浓度范围 0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer） (pH6.0);底物浓度 25mM，提取液用 Tris 缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer） (pH4.0 和 9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为 15mM。 脲酶 Urease (EC 3.5.1.5): 称取 5g 土（湿土），加 2.5ml 脲（80mM）和 20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡 旋振荡，旋转摇床 20℃，200rpm 振荡反应 4h。对照为加 2.5ml 灭菌蒸馏水和 20ml 硼酸缓 冲液。4h 后，处理中加 2。5ml 灭菌蒸馏水，对照中加 2。5ml 脲。然后用 30ml 酸化的 2M 氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床 20℃，200rpm 振荡 30min。9464×g 离心 5min，取 1ml 上 清夜与 9ml 蒸馏 水 、 5ml 水 杨 酸钠 （ sodium salicylate ） / 氢氧 化 钠 溶液 和 2ml dichloroisocyanuric acid(Na+ 盐)混允，20±2℃静置 1h， 在 690nm 波长下测定溶液的颜色强 度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围 0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶 活性（既脱氢酶活性）采用 Von Mersi 和 Schinner（1991）的方法测定。1g 鲜土置于带盖 的玻璃瓶中，加入 1.5ml 1M Tris 缓冲液（pH 7.0）和 2ml INT（5mg/ml，溶于 2%体积比的 二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加 1.5ml Tris 缓冲液和 2ml 蒸 馏水。旋转摇床 20℃，200rpm 培养 24h。 然后，往样品中加 2ml 蒸馏水，而往对照土样中 加 2ml INT。然后加 10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应， 20℃，200rpm 振荡 1h。9464×g 离心 5min，464nm 波长下测定上清夜的吸光值。对于中性 土壤用蒸馏水取代 Tris 缓冲液。用 INTF（ iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标 准曲线，浓度范围 0-27ug/ml 提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取 3g 鲜土，悬浮于 50ml 磷酸盐缓冲液，加入 250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照 加 250ul 蒸馏水。土壤悬浮液在 20℃，200rpm 培养 4h。 培养结束后，样品中加 250ul 蒸馏

水,而对照中加25 Oul fda。悬浮液涡旋振荡,取5m置于含5ml丙酮的试管中以终止反 应。9464×g离心5min,在490m波长下测定上清夜的光密度。FDA水解值通过以荧光素 浓度对光密度值制作的标准曲线查得(浓度范围0-10ug/ml) 参考文献 Taylor, J P, Wilson, B, Mills, M.S., Burns R.G., 2002. Comparison of microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques. Soil Biology and Biochemistry, 34, 387-401

水，而对照中加 250ul FDA。 悬浮液涡旋振荡，取 5ml 置于含 5ml 丙酮的试管中以终止反 应。9464×g 离心 5min，在 490nm 波长下测定上清夜的光密度。FDA 水解值通过以荧光素 浓度对光密度值制作的标准曲线查得（浓度范围 0-10ug/ml） 参考文献 Taylor, J.P., Wilson, B., Mills, M.S., Burns, R.G., 2002. Comparison of microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques. Soil Biology and Biochemistry, 34, 387-401