《土壤理化分析》课程教学资源（讲义）土壤蛋白酶测定

土壤蛋白酶测定(加勒斯江法) 1.分析意义 蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它 们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似,酶活性随 剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。 2.试验原理 蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽,肽进一步水解成氨基酸。 测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法,根据蛋白酶酶促蛋白质产物一氨基酸与某些物质 (如铜盐蓝色络合物或茚三酮等)生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的 关系,求出氨基酸量,以表示蛋白酶活性 3.试验步骤 取驾g过lm筛的风干土置于50mL容量瓶中,加入10mL1%用pH74磷酸盐缓冲溶 液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯(作为抑菌剂抑制微生物活动);在30℃恒温箱中培养 24h;培养结束后,将瓶中内容物过滤;取5mL滤液置于试管中,加入0.5mL0.IN硫酸和 3mL20%硫酸钠以沉淀蛋白质,然后滤λ50mL容量瓶,并加λlmL2%茚三酮溶液;将混 合物仔细摇荡,并在煮沸的水浴中加热1omin:将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度 线;最后在560nm处进行比色。 用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质(如石英砂)作对照,方法如前所述,以除掉土 壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量,根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知 4.试剂配制 1%白明胶溶液(用pH74的磷酸盐缓冲液配制); b.甲苯; c.磷酸盐缓冲液(pH74); d 0IN H2SO4 e. 20% Na2SO4 f.2%茚三酮溶液:将2g茚三酮溶于100mL丙酮,然后将95mL该溶液与1mLCH3COOH 和4mL水混合制成工作液(该工作液不稳定,只能在使用前配制) g.甘氨酸标准液:浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液:0.lg甘氨酸溶解于1L蒸馏 水中。再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸·lmL溶液的甘氨酸工作液

土壤蛋白酶测定（加勒斯江法） 1. 分析意义 蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它 们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随 剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。 2. 试验原理 蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。 测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质 （如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的 关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。 3. 试验步骤 取 2g 过 1mm 筛的风干土置于 50mL 容量瓶中，加入 10mL 1％用 pH7.4 磷酸盐缓冲溶 液配制的白明胶溶液和 0.5mL 甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在 30℃恒温箱中培养 24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取 5mL 滤液置于试管中，加入 0.5mL 0.1N 硫酸和 3mL 20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入 50mL 容量瓶，并加入 1mL 2％茚三酮溶液；将混 合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热 10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度 线；最后在 560nm 处进行比色。 用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土 壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。 4. 试剂配制 a. 1%白明胶溶液（用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液配制）； b. 甲苯； c. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）； d. 0.1N H2SO4; e. 20％ Na2SO4； f. 2％茚三酮溶液：将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH 和 4mL 水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）； g. 甘氨酸标准液：浓度为 1mL 含 100μg 甘氨酸的水溶液：0.1g 甘氨酸溶解于 1L 蒸馏 水中。再将该标液稀释 10 倍得 10μg 甘氨酸•1mL-1 溶液的甘氨酸工作液

标准曲线绘制:分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL该工作液于50mL容量瓶中即 获得甘氨酸浓度分别为0、02、0.6、1.0、1.4、1.8、22μg"mL的标准溶液梯度, 然后加入lmL2%茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡,并在煮沸的水浴中 加热10min。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在560nm处进行比色,最 后绘制标准曲线 5.结果计算: 土壤蛋白酶的活性,以24h后1g土壤中甘氨酸的微克数表示。 甘氨酸(g·g-)=c×50×ts 甘氨酸(μg"g1)-24小时后lg土壤中甘氨酸的微克数 c-标准曲线上查得的甘氨酸浓度,ugmL; 50一显色液体积,mL ts-分取倍数(这里是2=10/5 m一土壤质量, 方法来源:曹承绵,张志明,周礼恺。几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较土壤通报,1982, 13(2):39-40

标准曲线绘制：分别吸取 0、1、3、5、7、9、11mL 该工作液于 50mL 容量瓶中即 获得甘氨酸浓度分别为 0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg•mL-1 的标准溶液梯度， 然后加入 1mL 2％茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中 加热 10min。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在 560nm 处进行比色，最 后绘制标准曲线。 5. 结果计算： 土壤蛋白酶的活性，以 24h 后 1g 土壤中甘氨酸的微克数表示。 1 c 50 ts g g m  −   甘氨酸（ ）＝  甘氨酸（μg•g -1）－24 小时后 1g 土壤中甘氨酸的微克数； c－标准曲线上查得的甘氨酸浓度，μg•mL-1 ； 50－显色液体积，mL； ts－分取倍数（这里是 2＝10/5）； m－土壤质量，g。 方法来源：曹承绵, 张志明, 周礼恺. 几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较. 土壤通报, 1982, 13(2): 39-40