《生物化学》课程教学资源（讲义）三种基因编辑工具的比较

比较三种基因编辑技术 一、基因编辑的概念 基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定 位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此 过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了编辑基 因”。目前主要有3种基因编辑技术，分别为：)人工核酸酶介导的锌指核酸酶 (zinc-finger nucleases,ZFN)技术；b)转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术；C)RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶 (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas-based RNA- guided DNA endonucleases,CRISPR/Cas). 二、三种基因编辑技术的介绍 1.ZFN基因编辑技术 ZFN技术是第一代基因组编辑技术，功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的 锌指蛋白发展起来的.。ZFN由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)和FokI核酸内切酶组 成。其中，由ZP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合，而由FOkI构成的 切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可 以通过同源重组(HR)修复机制和非同源未端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修 复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而N日修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。 2.TALEN基因编辑技术 TALE(Transcription activator-like effectors)：一种源于植物致病菌Xanthomona函 Sp.的靶向基因操作技术，TALENs包含两个TALEN蛋白，每个TALEN都是由TALE aray与FokI融合而成.其中一个TALEN靶向正义链上靶标位点另一个则靶向反义 链上的靶标位点.然后FokI形成二聚体，在靶向序列中间的spacer处切割DNA,造成 双链DNA断裂，随后细跑启动DNA损伤修复机制，针对不同的TALEN骨架，其最适宜 的spacer长度不同，其长度范围一般为12~20bp.实验结果表明，TALENs在靶向DNA 时，第一个碱基为T时其结合效果更佳。 1/3

1 / 3 比较三种基因编辑技术 一、基因编辑的概念 基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定 位到基因组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此 过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基 因” 。目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： a)人工核酸酶介导的锌指核酸酶 (zinc- finger nucleases，ZFN)技术；b) 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术；c) RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶 技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA￾guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas )。 二、 三种基因编辑技术的介绍 1.ZFN 基因编辑技术 ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的 DNA 序列识别的 锌指蛋白发展起来的。ZFN 由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组 成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由 FokⅠ构成的 切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链 DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可 以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修 复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。 2.TALEN 基因编辑技术 TALE（Transcription activator -like effectors）:一种源于植物致病菌 Xanthomonas sp.的靶向基因操作技术。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向反义 链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成 双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的 TALEN 骨架, 其最适宜 的 spacer 长度不同, 其长度范围一般为 12~20 bp. 实验结果表明, TALENs 在靶向 DNA 时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳

3.CRISPR/Cas9基因组编辑技术 CRISPR/Cas系统由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成.转录的SgRNA折叠成特定的三 维结构后与Cas9蛋白形成复合体，指导Cas9核酸内切酶识别特定靶标位点，在P4M 序列上游处切割DNA造成双链DNA断裂，并启动DNA损伤修复机制.从不同菌种中 分离的CRISPR/Cas系统，其CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同， PAM序列也可能不同。最新报道，CRISPR-C2c2系统能够根据靶向序列特异地编辑单 链RNA. 三、 三种编辑技术的比较 1.共同点 结构的相似性：无论是ZFN、TALEN还是CRISPR/Cas9,都是由DNA识别域和 核酸内切酶两部分组成。其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA,而TALEN 的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为FON的核酸 内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA,Cas9蛋白负责DNA 的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸纳切酶或Cas9蛋白将DNA剪切 靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 作用过程的相似性：通过DNA识别模块对特异性的DNA位点识别并结合，然 后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的HD (同源定向修复)或NHE(非同源末端连接)途径修复过程完成特定序列的插入、删 除及基因融合。 2.不同点 三种基因编辑技术的差异 ZFN TALEN CRISRP系统 识别模式 蛋白质一DNA 蛋白质一DNA RNA-DNA 靶向元件 ZF array蛋白 TALE array蛋白 sgRNA蛋白 切割元件 FOkI蛋白 FOkI蛋白 Cas9蛋白 识别长度 (3-6)×3×2bp (12-20)×2bp 20bp 识别序列特点 以3bp为单位 5前一位为T 3'序列为NGC 213

2 / 3 3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术 CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与 sgRNA 构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三 维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中 分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的 sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。最新报道，CRISPR-C2c2 系统能够根据靶向序列特异地编辑单 链 RNA。 三、 三种编辑技术的比较 1.共同点 结构的相似性：无论是 ZFN、TALEN 还是 CRISPR /Cas9，都是由 DNA 识别域和 核酸内切酶两部分组成。其中 ZFN 技术具有锌指结构域能够识别靶点 DNA，而 TALEN 的 DNA 识别区域是重复可变双残基的重复，DNA 剪切区域都是一种名为 Fokl 的核酸 内切酶结构域。CRISPR 的 DNA 识别区域是 crRNA 或向导 RNA，Cas9 蛋白负责 DNA 的剪切。当 DNA 结合域识别靶点 DNA 序列后，核酸内切酶或 Cas9 蛋白将 DNA 剪切， 靶 DNA 双链断裂，再启动 DNA 损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 作用过程的相似性：通过ＤＮＡ识别模块对特异性的ＤＮＡ位点识别并结合，然 后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切，从而借助于细胞内固有的 HDR （同源定向修复）或 NHEJ（非同源末端连接）途径修复过程完成特定序列的插入、删 除及基因融合。 2.不同点 三种基因编辑技术的差异 ZFN TALEN CRISRP 系统 识别模式 蛋白质—DNA 蛋白质—DNA RNA—DNA 靶向元件 ZF array 蛋白 TALE array 蛋白 sgRNA 蛋白 切割元件 Fok I 蛋白 Fok I 蛋白 Cas9 蛋白 识别长度 （3-6）x 3 x 2 bp (12-20) x 2 bp 20 bp 识别序列特点 以 3 bp 为单位 5‘前一位为 T 3‘序列为 NGC

平台成熟、效率高 设计较ZFN简单、 靶向精确、脱靶率 优点 于被动同源重组 低、细胞毒性低 特异性高 廉价 细胞毒性、模块组 设计依赖上下游序 靶区前无PAM则不 装过程繁琐、需要 缺点 列、脱靶率高、具 大量测序工作、一 能切割、特异性不 高、NHE依然会产 有细胞毒性 般大型公司才有能 生随机毒性 力开展、成本高 能否编辑RNA 不可以 不可以 可以 313

3 / 3 优点 平台成熟、效率高 于被动同源重组 设计较 ZFN 简单、 特异性高 靶向精确、脱靶率 低、细胞毒性低、 廉价 缺点 设计依赖上下游序 列、脱靶率高、具 有细胞毒性 细胞毒性、模块组 装过程繁琐、需要 大量测序工作、一 般大型公司才有能 力开展、成本高 靶区前无 PAM 则不 能切割、特异性不 高、NHEJ 依然会产 生随机毒性 能否编辑 RNA 不可以 不可以 可以