山东第一医科大学（泰山医学院）：《医学免疫学》课程教学资源（授课教案）医学微生物实验教案

实验教案 课程名称医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验1.1革兰氏染色 实验分组情况6组 学时数2学时 实验目的 熟悉细菌革兰氏染色的原理及在细菌鉴定中的意义 2、掌握革兰氏染色的基本操作过程 利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同而导致对结晶紫和碘复合物的滞 实验原理 留程度的不同，经95%乙醇溶解脱色再用石炭酸复红复染时，将待检细菌 染成呈现兰紫色的革兰氏阳性菌和呈红色的革兰氏阴性菌 设各与材料 南落平板、接种环、革兰染色液、载玻片、光学显微镜、香柏油、擦镜纸 操作重点 革兰氏染色的原理和操作方法及其在细菌鉴定中的意义 操作难点 每步染色操作的时间把握 操作注意事项做到无菌操作 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、微生物实验室规则 10min 人身安全第一，仪器安全第二：规范操作，认真完成作业 二、显微镜油镜的使用：高倍镜向油镜转换，镜油滴加、（暗）视野查找、镜头 5min 擦洗 三、革兰氏染色细菌鉴定中的意义 5min (1)细茵细胞壁的组成 (2)细菌感染后的致病方式， (3)细菌感染的用药指导。 四、实验材料介绍： Smin 光学显微镜、革兰氏染色液、废液容器、大肠杆菌和金葡菌20r培养物 香柏油、擦镜纸、蒸馏水、吸水纸 五、染色过程（首先示教） 70min 包括涂片、初染、媒染、脱色、复染、镜检等过程，流程图如下： 结晶紫 ◆独液 →95%乙醇 复红 干燥 +镜检 六、实验报告 5min 叙述革兰氏染色过程及注意事项，绘出待检菌的者染形态并对染色结果进行 分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 1.1 革兰氏染色 实验分组情况 6 组 学时数 2 学时 实验目的 1、熟悉细菌革兰氏染色的原理及在细菌鉴定中的意义 2、掌握革兰氏染色的基本操作过程 实验原理 利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同而导致对结晶紫和碘复合物的滞 留程度的不同，经 95％乙醇溶解脱色再用石炭酸复红复染时，将待检细菌 染成呈现兰紫色的革兰氏阳性菌和呈红色的革兰氏阴性菌 设备与材料 菌落平板、接种环、革兰染色液、载玻片、光学显微镜、香柏油、擦镜纸 操作重点 革兰氏染色的原理和操作方法及其在细菌鉴定中的意义 操作难点 每步染色操作的时间把握 操作注意事项 做到无菌操作 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、微生物实验室规则 人身安全第一，仪器安全第二；规范操作，认真完成作业 二、显微镜油镜的使用：高倍镜向油镜转换，镜油滴加、（暗）视野查找、镜头 擦洗 三、革兰氏染色细菌鉴定中的意义 （1）细菌细胞壁的组成， （2）细菌感染后的致病方式， （3）细菌感染的用药指导。 四、实验材料介绍： 光学显微镜、革兰氏染色液、废液容器、大肠杆菌和金葡菌 20hr 培养物、 香柏油、擦镜纸、蒸馏水、吸水纸 五、染色过程（首先示教） 包括涂片、初染、媒染、脱色、复染、镜检等过程，流程图如下： 结晶紫 碘液 95%乙醇 复红 干燥 镜检 六、实验报告 叙述革兰氏染色过程及注意事项，绘出待检菌的着染形态并对染色结果进行 分析。 10min 5min 5min 5min 70min 5min

实验教案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验1.2细茵标本片观察 实验分组情况 6组 学时数1学时 实验目的 1、进一步熟悉光学显微镜油镜的使用 2、掌拥各种细菌的基本形态和特殊结构 实验原理 标本片观察 设备与材料 常见病原细菌的标本片、光学显微镜、香柏油、擦镜纸 操作重点 光学显微镜的使用方法 操作难点 光学显微镜的使用方法 操作注意事项 观察标本的同时保护好标本片 教学法 提问式 实验内容、步是、要求及时间分阳 ·、再次介绍显微镜油镜的使用：高倍镜向油镜转换，镜油滴加、（暗）视野查5min 找、镜头清洗 40min 二、 标本片观察 1、基本形态：球 一葡萄球菌、双球菌、链球菌 杆菌一一细杆菌、粗杆菌、分支杆菌 弧南一一霍乱弧菌 2、特殊结构：单鞭毛、周身鞭毛、荚膜、芽孢 三、实验报告 5min 描绘标本片上可见常见病原菌的基本形态和特殊结构

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 1.2 细菌标本片观察 实验分组情况 6 组 学时数 1 学时 实验目的 1、进一步熟悉光学显微镜油镜的使用 2、掌握各种细菌的基本形态和特殊结构 实验原理 标本片观察 设备与材料 常见病原细菌的标本片、光学显微镜、香柏油、擦镜纸 操作重点 光学显微镜的使用方法 操作难点 光学显微镜的使用方法 操作注意事项 观察标本的同时保护好标本片 教学法 提问式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、再次介绍显微镜油镜的使用：高倍镜向油镜转换，镜油滴加、（暗）视野查 找、镜头清洗 二、标本片观察 1、基本形态：球——葡萄球菌、双球菌、链球菌 杆菌——细杆菌、粗杆菌、分支杆菌 弧菌——霍乱弧菌 2、特殊结构：单鞭毛、周身鞭毛、荚膜、芽孢 三、实验报告 描绘标本片上可见常见病原菌的基本形态和特殊结构。 5min 40min 5min

实验教案 课程名称医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验2.1细菌的分离与培养和体表细菌检查 实验分组情况 6组 学时数0.5学时 熟悉细菌的分离与培养的原理及实际应用 实验目的 2、 掌握细菌的分离与培养的方式类型与基本操作 3、了解人体表细菌的分布 实验原理 提供细菌完成生长繁殖、新陈代谢的所需条件，以不同的方式使其能够大 量生长、 随 设备与材料 普通营养琼脂平板，液体/半固体培基，接种环/针，待检细菌的20液体 培养物，记号笔，恒温培养箱 操作重点 细菌的分离与培养的原理及实际应用 操作难点 细菌的分离与培养的方式类型与基本操作 操作注意事项 接种过程中手法要轻 教学法 启发诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、细菌分离与培养的实际应用 5min (1)细茵分离、活化、培养， (2)细茵的选择、鉴定， (3)细菌的保种。 20min 三、操作过程： 1、平板一一接种环，划线“之”字形或者“井”字形： 半固体一一接种针，穿刺： 液体一一接种环针、直滴管 2、体表细菌的分离： 将唾液、汗水、 头皮屑等接种至相应培基中 3、置37℃恒温培养箱中20hr,取出观察结果。 5min 四、实验报告 叙述细菌分离培养的各种操作过程及注意事项，并对培养结果进行分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 2.1 细菌的分离与培养和体表细菌检查 实验分组情况 6 组 学时数 0.5 学时 实验目的 1、熟悉细菌的分离与培养的原理及实际应用 2、掌握细菌的分离与培养的方式类型与基本操作 3、了解人体表细菌的分布 实验原理 提供细菌完成生长繁殖、新陈代谢的所需条件，以不同的方式使其能够大 量生长、繁殖 设备与材料 普通营养琼脂平板，液体/半固体培基，接种环/针，待检细菌的 20hr 液体 培养物，记号笔，恒温培养箱 操作重点 细菌的分离与培养的原理及实际应用 操作难点 细菌的分离与培养的方式类型与基本操作 操作注意事项 接种过程中手法要轻 教学法 启发诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、细菌分离与培养的实际应用 （1）细菌分离、活化、培养， （2）细菌的选择、鉴定， （3）细菌的保种。 三、操作过程： 1、平板——接种环，划线“之”字形或者“井”字形； 半固体——接种针，穿刺； 液体——接种环/针、直滴管 2、体表细菌的分离：将唾液、汗水、头皮屑等接种至相应培基中 3、置 37℃恒温培养箱中 20hr，取出观察结果。 四、实验报告 叙述细菌分离培养的各种操作过程及注意事项，并对培养结果进行分析。 5min 5min 20min 5min

实验教案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验2.2药敏试验 实验分组情况 6组 学时数1学时 1、熟悉细菌药敏试验的原理及其临床意义 实验目的 2、了解各种药敏试验方法 3、掌握试纸片法药敏试验的基本操作过程和结果的判定 实验原理 利用生物、化学药物可进入细菌细胞体内干扰或阻断其支持结构、核酸 玉白的合成和生物功能的发挥，从而表现出抑或杀离效 设备与材料 普通营养琼脂平板，接种环、无菌棉拭子，药敏试纸，手术镊，待检细菌 的20液体培养物，记号笔，恒温培养箱，直尺 操作重点 细菌药敏试验的原理及其临床意义 操作难点 试纸片法的基本操作过程和结果判定 操作注意事项 细菌划线的手法 教学法 启发诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 、复习、总结上次实验的内容和注意事项 5min 二、细菌药敏试验的临床意义 5min (1)推论细菌细胞壁的组成、革兰氏染色的者染特性， (2)细黄感染后的致病方式和类型. (3)细茵感染的用药指导。 三、操作过程： 35min 1、用接种环或棉拭子将检细菌液体培养物无南操作均匀涂布普通营养琼脂平 板，稍置待水渗下： 2、用手术慑无菌操作按正五边形分布将药敏试纸展平后加贴于涂菌平板上 3、将平板倒置于37℃恒温培养箱培养20r,取出观察、测量结果。 四、实验报告 5min 叙述细菌药敏试验的操作过程及注意事项，并对试验结果进行分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 2.2 药敏试验 实验分组情况 6 组 学时数 1 学时 实验目的 1、熟悉细菌药敏试验的原理及其临床意义 2、了解各种药敏试验方法 3、掌握试纸片法药敏试验的基本操作过程和结果的判定 实验原理 利用生物、化学药物可进入细菌细胞体内干扰或阻断其支持结构、核酸、 蛋白的合成和生物功能的发挥，从而表现出抑菌或杀菌效果 设备与材料 普通营养琼脂平板，接种环、无菌棉拭子，药敏试纸，手术镊，待检细菌 的 20hr 液体培养物，记号笔，恒温培养箱，直尺 操作重点 细菌药敏试验的原理及其临床意义 操作难点 试纸片法的基本操作过程和结果判定 操作注意事项 细菌划线的手法 教学法 启发诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、细菌药敏试验的临床意义 （1）推论细菌细胞壁的组成、革兰氏染色的着染特性， （2）细菌感染后的致病方式和类型， （3）细菌感染的用药指导。 三、操作过程： 1、用接种环或棉拭子将检细菌液体培养物无菌操作均匀涂布普通营养琼脂平 板，稍置待水渗下； 2、用手术镊无菌操作按正五边形分布将药敏试纸展平后加贴于涂菌平板上； 3、将平板倒置于 37℃恒温培养箱培养 20hr，取出观察、测量结果。 四、实验报告 叙述细菌药敏试验的操作过程及注意事项，并对试验结果进行分析。 5min 5min 35min 5min

实验教案 课程名称医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验2.3生化（五糖发酵）试验 实验分组情况 6组 学时数1.5学时 熟悉细菌生化试验的原理及其临床意义 实验目的 2、 了解各种生化试验方法 3、掌握微量发酵管法基本操作过程和结果的判定 实验原理 细菌体内含有一些酶类，在新陈代谢过程中产生酸碱代谢产物或者气体， 用化学 方法可将其区 设备与材料 普通营养琼脂平板，接种针，待检细菌的20液体培养物，五糖微量发酵 管，记号笔，恒温培养箱 操作重点 细菌生化试验的原理及其临床意义 操作难点 微量发酵管法基本操作过程和结果的判定 操作注意事项液体接种细菌的方法细节 教学法 提问式 实验内容、步骤、要求及时间分配 复习、总结上次实验的内容和注意事项 15min 二、细菌生化试验的原理及其临床意义 1、原理：微生物基因组染色体编码产生的各种酶类，一类是将自身结构成份降 解进行新陈代谢，另一种是将外环境中的营养物质进行适当降解后摄 取到体内完成同化过程。这两个过程中产生的中间产物、终产物亦有 所不同。从而可人为控制培养基中微生物生长必需的碳源营养组 成，加以酸碱指示剂，接种不同微生物后，据培养液的颜色变化和 体的有无来判断改种微生物对相应营养物质的利用情况，从而推论其 是否具有相应的酶类。 5min 2、临床意义：(1)推导细菌代谢酶类的组成， (2)指导细菌的分离培养、诊断和鉴定 (3)指导了解细菌感染后可能的致病因子。 5min 三、操作过程： 1、用小砂轮环切后掰开发酵管，注意保留标签 2、用消毒好的接种针勾取细菌，小心接种于一个发酵管内，接种完毕接种针灭 35min 茵冷知 3、依次接种于其余四种糖发酵管内。 4、用胶布把五个发酵管固定好，开口向下放置于37℃温箱内过夜培养，观察 结果 5min 四、实验报告 叙述糖发酵试验的操作过程及注意事项，并对试验结果进行分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 2.3 生化（五糖发酵）试验 实验分组情况 6 组 学时数 1.5 学时 实验目的 1、熟悉细菌生化试验的原理及其临床意义 2、了解各种生化试验方法 3、掌握微量发酵管法基本操作过程和结果的判定 实验原理 细菌体内含有一些酶类，在新陈代谢过程中产生酸碱代谢产物或者气体， 用化学方法可以将其区别 设备与材料 普通营养琼脂平板，接种针，待检细菌的 20hr 液体培养物，五糖微量发酵 管，记号笔，恒温培养箱 操作重点 细菌生化试验的原理及其临床意义 操作难点 微量发酵管法基本操作过程和结果的判定 操作注意事项 液体接种细菌的方法细节 教学法 提问式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、细菌生化试验的原理及其临床意义 1、原理：微生物基因组染色体编码产生的各种酶类，一类是将自身结构成份降 解进行新陈代谢，另一种是将外环境中的营养物质进行适当降解后摄 取到体内完成同化过程。这两个过程中产生的中间产物、终产物亦有 所不同。从而可人为控制培养基中微生物生长必需的碳氮源营养组 成，加以酸碱指示剂，接种不同微生物后，据培养液的颜色变化和气 体的有无来判断改种微生物对相应营养物质的利用情况，从而推论其 是否具有相应的酶类。 2、临床意义：（1）推导细菌代谢酶类的组成， （2）指导细菌的分离培养、诊断和鉴定， （3）指导了解细菌感染后可能的致病因子。 三、操作过程： 1、用小砂轮环切后掰开发酵管，注意保留标签 2、用消毒好的接种针勾取细菌，小心接种于一个发酵管内，接种完毕接种针灭 菌冷却 3、依次接种于其余四种糖发酵管内。 4、用胶布把五个发酵管固定好，开口向下放置于 37℃温箱内过夜培养，观察 结果 四、实验报告 叙述糖发酵试验的操作过程及注意事项，并对试验结果进行分析。 5min 15min 5min 5min 35min 5min

实验教案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验3.1凿试验 实验分组情况 6组 学时数1.5学时 实验目的 1、熟悉鲨试验的原理及在细菌鉴定中的意义 2、掌据鲨试验的基本操作过程 指血液中变形细朐的血浆凝固酶酶原，在接触到内毒素后被激活成有活性 实验原理 的血浆凝固酶，从而启动血浆凝固反应，使液体转呈凝固态 设备与材料 鲎试剂、标准内毒素、微量移液器、自来水、生理盐水、温箱 操作重点 鲎试验的原理及在细菌鉴定中的意义 操作难点 鲎试验的原理及在细菌鉴定中的意义 操作注意事项安瓿的打开方式 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 5min 二、原理：鲎血液中变形细胞的血浆凝固酶酶原，在接触到内毒素后被激活成 5min 有活性的血浆凝固醇，从而启动血浆凝固反应，使液体转呈凝固态 当检测样品中含有微量的内毒素的时候，鲎试剂可与之发生一系列 反应，形成肉眼可见的胶状凝固物质（凝固蛋白）。 5min 三、检测步骤： 1、把三支鲎试剂溶解于无热原质的0.1l重蒸水中，并分别标记为样品管 50min 阳性对照管、阴性对照管： 2、分别把取标准内毒素（预先0.5ml重蒸水溶解）、自来水、被测样品的0.1m 溶液加入相应试管中，混匀：垂直浸入37℃水浴保温反应20一30分钟 3、垂直取出微微倾斜并抖动，观察结果。 5min 四、实验报告 叙述鲨试验的基本操作过程及注意事项，并对其结果进行判断、分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 3.1 鲎试验 实验分组情况 6 组 学时数 1.5 学时 实验目的 1、熟悉鲎试验的原理及在细菌鉴定中的意义 2、掌握鲎试验的基本操作过程 实验原理 鲎血液中变形细胞的血浆凝固酶酶原，在接触到内毒素后被激活成有活性 的血浆凝固酶，从而启动血浆凝固反应，使液体转呈凝固态 设备与材料 鲎试剂、标准内毒素、微量移液器、自来水、生理盐水、温箱 操作重点 鲎试验的原理及在细菌鉴定中的意义 操作难点 鲎试验的原理及在细菌鉴定中的意义 操作注意事项 安瓿的打开方式 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、二、原理：鲎血液中变形细胞的血浆凝固酶酶原，在接触到内毒素后被激活成 有活性的血浆凝固酶，从而启动血浆凝固反应，使液体转呈凝固态。 当检测样品中含有微量的内毒素的时候，鲎试剂可与之发生一系列 反应，形成肉眼可见的胶状凝固物质（凝固蛋白）。 三、检测步骤： 1、把三支鲎试剂溶解于无热原质的 0.1ml 重蒸水中，并分别标记为样品管、 阳性对照管、阴性对照管； 2、分别把取标准内毒素（预先 0.5ml 重蒸水溶解）、自来水、被测样品的 0.1ml 溶液加入相应试管中，混匀；垂直浸入 37℃水浴保温反应 20－30 分钟； 3、垂直取出微微倾斜并抖动，观察结果。 四、实验报告 叙述鲎试验的基本操作过程及注意事项，并对其结果进行判断、分析。 5min 5min 5min 50min 5min

实验教案 课程名称医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验3.2抗酸染色 实验分组情况6组 学时数1.5学时 实验目的 熟悉分支杆菌抗酸染色的原理及其临床意义 2、掌探抗酸染色的基本操作方法 结核分支杆菌的细胞壁中类脂成分含量较高、对水溶性染料普通染色时不 实验原理 易若染的特点，在热力作用下石炭酸复红穿透脂质而对其细胞壁若染 设备与材料 光学显微镜、抗酸染色试剂、染色容器及医用卡介苗冻干粉 操作重点 抗酸染色的原理及其在细菌鉴定中的意义 操作难点 抗酸染色的操作方法 操作注意事项 加热若染操作的加液和时间掌握 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上一实验的内容和注意事项 5min 一、抗酸热鱼的原理及其临床章义 20min 1、原理：利用结核分支杆菌的细胞壁中类脂成分含量较高、对水溶性染料普通 染色时不易着染的特点，在热力作用下石炭酸复红穿透脂质而对其细 胞壁着染，再以水性美兰室温复染：从而将待检样品中的结核分支杆 菌染成红色，其它杂菌和背景染成蓝色。 2、临床意义：(1)判定感染标本中的病原菌 (2)判定标本中病原菌细胞壁的可能组成 三、染色过程 40min 1、用蒸馏水溶解卡介苗冻干粉，并涂片、固定 2、以玻片夹持夹水平夹持涂片，滴加石炭酸复红覆盖样品膜，移至酒精灯正上 方适宜距离持续加热，同时开始计时：待染液将要蒸发干前将涂片挪离热源 并停止计时：待涂片冷却后补加染液重新加热、计时直至累计加热5mi 3、到时将涂片放冷，水洗后用3%盐酸酒精脱色1min,水洗 4、以碱性美兰复染lmin,水洗后干燥镜检。 四、实验报告 5min 叙述抗酸染色过程及注意事项，并对其结果进行判定和分析

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 3.2 抗酸染色 实验分组情况 6 组 学时数 1.5 学时 实验目的 1、熟悉分支杆菌抗酸染色的原理及其临床意义 2、掌握抗酸染色的基本操作方法 实验原理 结核分支杆菌的细胞壁中类脂成分含量较高、对水溶性染料普通染色时不 易着染的特点，在热力作用下石炭酸复红穿透脂质而对其细胞壁着染 设备与材料 光学显微镜、抗酸染色试剂、染色容器及医用卡介苗冻干粉 操作重点 抗酸染色的原理及其在细菌鉴定中的意义 操作难点 抗酸染色的操作方法 操作注意事项 加热着染操作的加液和时间掌握 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上一实验的内容和注意事项 二、抗酸染色的原理及其临床意义 1、原理：利用结核分支杆菌的细胞壁中类脂成分含量较高、对水溶性染料普通 染色时不易着染的特点，在热力作用下石炭酸复红穿透脂质而对其细 胞壁着染，再以水性美兰室温复染；从而将待检样品中的结核分支杆 菌染成红色，其它杂菌和背景染成蓝色。 2、临床意义：（1）判定感染标本中的病原菌 （2）判定标本中病原菌细胞壁的可能组成 三、染色过程 1、用蒸馏水溶解卡介苗冻干粉，并涂片、固定 2、以玻片夹持夹水平夹持涂片，滴加石炭酸复红覆盖样品膜，移至酒精灯正上 方适宜距离持续加热，同时开始计时；待染液将要蒸发干前将涂片挪离热源、 并停止计时；待涂片冷却后补加染液重新加热、计时直至累计加热 5min 3、到时将涂片放冷，水洗后用 3%盐酸酒精脱色 1min，水洗 4、以碱性美兰复染 1min，水洗后干燥镜检。 四、实验报告 叙述抗酸染色过程及注意事项，并对其结果进行判定和分析。 5min 20min 40min 5min

实验教案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验4乙型肝炎病毒的抗原抗体检测 实验分组情况 6组 学时数3学时 熟悉乙型肝炎病毒 二对半”的由来及其临床意义 实验目的 2、掌拥乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理 3、熟悉临床乙型肝炎病毒“二对半”检测试剂盒的应用 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原 或抗体仍保持其免疫学活性。 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性 又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相 载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 实验原理 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过 反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 定的比例 加入酶反应的底 奶后， 底物被酶催化成为有色 物的量 与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量 析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法 达到很高的敏感度。 乙型肝炎病毒“二对半”检测试剂盒（五种），血液，一次性注射器， 一次 设备与材料 性试管，离心机，微量移液器，吸头，蒸馏水 恒温箱，吸水纸 操作重点 乙型肝炎病毒“二对半”的由来、临床意义 操作难点 乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理 操作注意事项 加样时，试剂盒与反应板一一对应 教学法 启发、诱导式 实哈内容、步摩、要求及时间分 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 5min 二、乙型肝炎病毒“二对半”的由来及其临床意义 1、第一对：BsAg与Bs仙，乙型肝炎病毒表面抗原，位于Dane颗粒的外衣壳上 是Dane颗粒感染机体时被免疫系统识别的标志，并由此产生相应的免疫反应（细 胞免疫，体液免疫)，即BsAb出现。BsAg大量存在于感染者血液中是BV感 染的主要标志，而BsAb的存在则仅表明机体曾经或己经接触过BsAg。 2、第一对，HBeAg与HBeAb.HBeAg是prC翻加工后的产物，游离于血液中 其消长与病毒体及DA聚合酶的消长基本一致，可作为BV复制及具有强 感染性的标志：而且它还可能与BV的免疫耐受有关。而BeAg被机体免 疫系统识别后诱发产生的Bb可诱生补体介导的细胞毒作用，对BV 感染有一定的保护作用，也是预后良好的象征。 3、第三对：HBcAg与HBcAb,Hecag是Dane题粒的内衣壳蛋白外被贯穿HBeA 的包膜而被屏蔽， 一方面在血流中不易检出，另一方面Dae颗粒感染机体时它

实 验 教 案 课程名称 医学微生物学 授课专业及层次 实验项目 实验 4 乙型肝炎病毒的抗原抗体检测 实验分组情况 6 组 学时数 3 学时 实验目的 1、熟悉乙型肝炎病毒“二对半”的由来及其临床意义 2、掌握乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理 3、熟悉临床乙型肝炎病毒“二对半”检测试剂盒的应用 实验原理 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原 或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相 载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过 反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一 定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量 与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分 析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法 达到很高的敏感度。 设备与材料 乙型肝炎病毒“二对半”检测试剂盒（五种），血液，一次性注射器，一次 性试管，离心机，微量移液器，吸头，蒸馏水，恒温箱，吸水纸 操作重点 乙型肝炎病毒“二对半”的由来、临床意义 操作难点 乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理 操作注意事项 加样时，试剂盒与反应板一一对应 教学法 启发、诱导式 实验内容、步骤、要求及时间分配 一、复习、总结上次实验的内容和注意事项 二、乙型肝炎病毒“二对半”的由来及其临床意义 1、第一对:HBsAg 与 HBsAb,乙型肝炎病毒表面抗原，位于 Dane 颗粒的外衣壳上， 是 Dane 颗粒感染机体时被免疫系统识别的标志，并由此产生相应的免疫反应（细 胞免疫，体液免疫），即 HBsAb 出现。HBsAg 大量存在于感染者血液中是 HBV 感 染的主要标志，而 HBsAb 的存在则仅表明机体曾经或已经接触过 HBsAg。 2、第二对：HBeAg 与 HBeAb，HBeAg 是 PreC 翻译加工后的产物，游离于血液中， 其消长与病毒体及 DNA 聚合酶的消长基本一致，可作为 HBV 复制及具有强 感染性的标志；而且它还可能与 HBV 的免疫耐受有关。而 HBeAg 被机体免 疫系统识别后诱发产生的 HBeAb 可诱生补体介导的细胞毒作用，对 HBV 感染有一定的保护作用，也是预后良好的象征。 3、第三对：HBcAg 与 HBcAb，HBcAg 是 Dane 颗粒的内衣壳蛋白外被贯穿 HBeAg 的包膜而被屏蔽，一方面在血流中不易检出，另一方面 Dane 颗粒感染机体时它 5min 35min

不能与免疫系统接触而透发免疫反应，从而此阶段没有HBAb的产生。只有当 HRV DNA成垫、复制后表达出HRcAg流离于咸达细胞中时，它才制将鱼疼系统活 发免疫反应（细胞免疫，体液免疫），即Bc仙出现 其中，HBcIgG是非保 抗体，BcIM的存在提示BV处于复制状态：同时诱发的细胞反应对BV的清 除起重要作用。故常仅检测HBcAb或HBcIgM。 三、乙型肝炎病毒“二对半”的检测方法 35min 应用免疫学ESA方法进行检测，其中重要与关键的酶标复合物 1、HBsAg、BeAg、HBsAb的检测用双Ab或Ag夹心ELISA法：包被McAb或A -待检样品 一Ab-或Ag-RP,若样品中存在待检Ag或Ab,则形成McA北 或Ag-Ag或Ab-Ab-或Ag-HRP复合物，加入TMB后显色，显色程度与Ag或 Ab的量呈正比：若无Ag或Ab,则不显色。 而BsAg的检测用双位点一步夹心法：包被McHBsAb一一待检血清 -McHRsAh* -HRP,若样品中存在HBsAg,形成McHBsAb-HBsAg-McHBsAb-HRP复合物，加 入TMB后显色，显色程度与HBsAg的量呈正比：若无HBsAg,则不显色。 检测指标包被 被测 酶结合物 ①.HBsAg HBsAb +HBsAb-HRD显色(+) ②.BsA HBsAb HBsAg-HRP 显色(+) ③.HbeAg HBeAb +HBeAg+BeAb-RP显色(+) 2、BeAb的检测用中和抑制ELISA法：包被McHBeAb-一 一待检血洁-Hreag-HBeA -RP,若样品中存在BeAb,则形成的BeAg-BeAb和BeAg-BeAb-HRP同时上 包被的McHEeAb竞争结合，但据形成的HEeAg-BeAb和HBeAg-Beb-RP复 物方程的平衡常数得知HBeAg-McHBeAb-RP的量与样品BeAb的量呈反比，故 加入TB后显色程度与B出的量呈反比：若样品中无HBcAb,则显色达最深。 检测指标 包被 被测 酶结合物 ④.HReAb HBeAg+ HBeAb + IBeAb-HR即显色(-) 3、Bcb的检测用竞争抑制ELISA法：包被BcAg—一待检血清-McHBcAb-RP 若样品中存在BcAb,则据形成的BcAg-BcAb和IBcAg-McHBcAb -HRP复合物方程的平衡常数得知HBcAg-McHBcAb-HRP的量与样 品HBcAb的量呈反比，故加入TB后显色程度与Bcb的量呈反 比：若样品中无Bcb,则显色达最深。 检测指标 包被 被测 酶结合物 ⑤.HBcAb HBcAg+HBcAb+HBcAb-HRP显色(-) 四、试验操作一一严格按试剂盒说明书进行 70min 1、从冷藏箱中取出试剂盒反应板每种四个孔，在室温下平衡30min,标记“+ ,样品 空白”，同时将浓缩洗 液作1：20稀释： 2、加待测样品50ul,对照试剂各1滴(50ul): 3、加酶结合物，每孔加入相应的酶复合物1滴，充分混匀后置37℃30min: 4、洗板，弃去反应液，拍干：用稀释洗涤液注满每孔后静置10~15s,弃去拍

不能与免疫系统接触而诱发免疫反应，从而此阶段没有 HBcAb 的产生。只有当 HBV DNA 感染、复制后表达出 HBcAg 游离于感染细胞中时，它才刺激免疫系统诱 发免疫反应（细胞免疫，体液免疫），即 HBcAb 出现；其中，HBcIgG 是非保护性 抗体，HBcIgM 的存在提示 HBV 处于复制状态；同时诱发的细胞反应对 HBV 的清 除起重要作用。故常仅检测 HBcAb 或 HBcIgM。 三、乙型肝炎病毒“二对半”的检测方法 应用免疫学 ELISA 方法进行检测，其中重要与关键的酶标复合物。 1、HBsAg、HBeAg、HBsAb 的检测用双 Ab 或 Ag 夹心 ELISA 法：包被 McAb 或 Ag ——待检样品——Ab­或 Ag­HRP，若样品中存在待检 Ag 或 Ab，则形成 McAb 或 Ag-Ag­或 Ab-Ab­或 Ag­HRP 复合物，加入 TMB 后显色，显色程度与 Ag 或 Ab 的量呈正比；若无 Ag 或 Ab，则不显色。 而HBsAg的检测用双位点一步夹心法：包被McHBsAb1——待检血清——McHBsAb2 ­HRP，若样品中存在 HBsAg，形成 McHBsAb1 -HBsAg-McHBsAb2 ­HRP 复合物，加 入 TMB 后显色，显色程度与 HBsAg 的量呈正比；若无 HBsAg，则不显色。 检测指标 包被 被测 酶结合物 ①.HBsAg HBsAb + HBsAg + HBsAb-HRP 显色（+） ②.HBsAb HBsAg + HBsAb + HBsAg-HRP 显色（+） ③.HbeAg HBeAb + HBeAg + HBeAb-HRP 显色（+） 2、HBeAb 的检测用中和抑制 ELISA 法：包被 McHBeAb——待检血清-HBeAg-HBeAb ­HRP，若样品中存在 HBeAb，则形成的 HBeAg-HBeAb 和 HBeAg-HBeAb­HRP 同时与 包被的 McHBeAb 竞争结合，但据形成的 HBeAg-HBeAb 和 HBeAg-HBeAb­HRP 复合 物方程的平衡常数得知 HBeAg-McHBeAb­HRP 的量与样品 HBeAb 的量呈反比，故 加入 TMB 后显色程度与 HBeAb 的量呈反比；若样品中无 HBcAb，则显色达最深。 检测指标 包被 被测 酶结合物 ④．HBeAb HBeAg + HBeAb + HBeAb-HRP 显色（-） 3、HBcAb 的检测用竞争抑制 ELISA 法：包被 HBcAg——待检血清-McHBcAb­HRP， 若样品中存在HBcAb，则据形成的HBcAg-HBcAb和HBcAg-McHBcAb ­HRP 复合物方程的平衡常数得知 HBcAg-McHBcAb­HRP 的量与样 品 HBcAb 的量呈反比，故加入 TMB 后显色程度与 HBcAb 的量呈反 比；若样品中无 HBcAb，则显色达最深。 检测指标 包被 被测 酶结合物 ⑤． HBcAb HBcAg + HBcAb + HBcAb-HRP 显色（-） 四、试验操作——严格按试剂盒说明书进行 1、从冷藏箱中取出试剂盒反应板每种四个孔，在室温下平衡 30min，标记“＋， －，样品，空白”，同时将浓缩洗涤液作 1:20 稀释； 2、加待测样品 50µl，对照试剂各 1 滴（50µl）； 3、加酶结合物，每孔加入相应的酶复合物 1 滴，充分混匀后置 37℃ 30min； 4、洗板，弃去反应液，拍干；用稀释洗涤液注满每孔后静置 10～15s，弃去拍 35min 70min

重复5次，最后拍 5、加显色剂：依次向每孔中加入底物液各1滴、显色液1滴，充分混匀后置37( 避光15min: 6、结果测定与判定：目测各孔中反应液的颜色并分析待检目的物的存在状态 六、实验报告 5min 叙述乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理、操作过程及注意事项，并对其结果 进行判定和分析

干，重复 5 次，最后拍干； 5、加显色剂：依次向每孔中加入底物液各 1 滴、显色液 1 滴，充分混匀后置 37℃ 避光 15min； 6、结果测定与判定：目测各孔中反应液的颜色并分析待检目的物的存在状态 六、实验报告 叙述乙型肝炎病毒“二对半”的检测原理、操作过程及注意事项，并对其结果 进行判定和分析。 5min