华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第六讲 外源基因在大肠杆菌中的表达

生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展

生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展

基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化

6外源基因在大肠杆菌中的表达 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C大肠杄菌基因工程菌的构建策略 D基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

6外源基因在大肠杆菌中的表达 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌表达外源基因的优势 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 批准为安全的基因工程受体生物

6外源基因在大肠杆菌中的表达 A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌表达外源基因的劣势 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 细胞周质内含有种类繁多的内毒素

6外源基因在大肠杆菌中的表达 B外源基因在大肠杄菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 ●质粒拷贝数

B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 启动子 启动子 终止子 终止子 核糖体结合位点 核糖体结合位点 密码子 密码子 质粒拷贝数 质粒拷贝数

启动子 目的基因 启动子最佳距离的探测 目的基因 A酶切开 启动子 Ba31酶解

启动子 启动子最佳距离的探测 启动子最佳距离的探测 目的基因 目的基因 EE EE AA EE EE 启动子 启动子 A A 酶切开 酶切开 Bal31 Bal31酶解酶解 目的基因 目的基因

启动子 启动子的筛选 = 采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段 终止密码子 克隆到启动子探针质粒pKO1上 Ap 受体细胞染色体DNA上的ga/、gaT与质 pKo 粒上报告基因gk的表达产物联合作用, or 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化gat、ga冖、gaK的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆

启动子 启动子的筛选动筛 Ap Aprr ori ori pKO1 pKO1 galK galK 采用鸟枪法战略，将合适大小的 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA DNA片段片段 终止密码子 终止密码子 克隆到启动子探针质粒 克隆到启动子探针质粒pKO1 pKO1上上 受体细胞染色体 受体细胞染色体DNA DNA上的上的galE galE、、galT galT与质与质 粒上报告基因 粒上报告基因galk galk的表达产物联合作用， 的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+、galT+、galK 转化galE+、galT+、galK--的大肠杆菌受体菌株 的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 含有外源启动子活性的重组克隆

启动子 启动子的构建 启动子 -35区序列 -10区序列 PGA A G AT CT recA GA A traA A CA AATGT trp IGAC A TA A CT ac AC A tac GA A ATA A tac =3 Ptrp =11 Plac

启动子 启动子的构建动构 -35 -35 区序列 区序列 -10 -10 区序列 区序列 PPλλLL PPrecA recA PPtrptrp PPlac lac PPtraA traA PPtac tac 启动子 启动子 T T G A C A T T G A C A G A T A C T G A T A C T T T G A T A T T G A T A T A T A A T T A T A A T T T G A C A T T G A C A T T A A C T T T A A C T T A G A C A T A G A C A T A A T G T T A A T G T T T T A C A T T T A C A T A T A A T T A T A A T T T G A C A T T G A C A T A T A A T T A T A A T PPtac tac = 3 Ptrp = 11 Plac = 3 Ptrp = 11 Plac

启动子 启动子的可控性 基底水平转录 乳糖启动子P的可控性 阻遏蛋白 野生型的Pac与其控制区Oa 偶联在一起,在没有诱导物 存在时,整个操纵子处于基乳糖异丙基β-D-硫 代半乳糖苷(|PTG) 诱导 底水平表达;诱导物可以使 启动子P介导的转录大幅 二份)《 二)《 高效转录 提高

启动子 启动子的可控性 启动子的可控性 PP 乳糖启动子 乳糖启动子PPlac lac的可控性： 的可控性： OO PP OO 高效转录 高效转录 阻遏蛋白 阻遏蛋白 诱导诱导 乳糖 异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 乳糖 异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 野生型的 野生型的Plac与其控制区Olac Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 存在时，整个操纵子处于基 基底水平转录 基底水平转录 底水平表达；诱导物可以使 底水平表达；诱导物可以使 启动子 启动子PPlaclac介导的转录大幅 介导的转录大幅 提高提高