华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第五讲 目的基因的克隆与基因文库的构建

生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展

生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展

基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化

5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 B CDNA法 CPCR法 D化学合成法 E基因文库的构建

5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 C PCR C PCR法 B cDNA B cDNA法 A 鸟枪法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 基因文库的构建

5目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和 生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌 (细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。 般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然 后将之克隆表达

5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达

5目的基因的克隆与基因文库的构建 A鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性

A 鸟枪法 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的局限性

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开, 大小不可控 部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体 转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杄菌作 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体 染色体DNA DNA的切断 的切断 超声波处理： 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 大小不可控 部分酶切： 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 转化受体细胞 转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）

鸟枪法操作的改进 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率

鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA DNA

鸟枪法操作的改进 在连接前将DNA片段进行分级分离 例如,已知某目的基因位于1.8kb的Sal 片段中,将染色体DNA用S叫切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块,从此 2.0kb 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进 1.8kb 1.6kb 行拼接

鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb

鸟枪法操作的改进 凝胶DNA片段回收技术 冻融法 滤纸法 ●吸附法 氐融点凝胶法 ●溶解法

鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术