华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第三讲 重组DNA技术所需的基本条件

生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展

生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展

基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化

3重组DNA技术所需的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 B用于基因克隆的载体 C用于基因转移的受体菌或细胞

3 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 C 用于基因转移的受体菌或细胞 用于基因转移的受体菌或细胞 B 用于基因克隆的载体 用于基因克隆的载体 A 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶

3重组DNA技术所需的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 狠制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 ●核酸修饰酶

A 用于核酸操作的工具酶 用于核酸操作的工具酶 3 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA DNA聚合酶 聚合酶 核酸酶 核酸酶 核酸修饰酶 核酸修饰酶

限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 只别双链DNA分子中的特定序列,并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsdR:编码限制性核酸內切酶 hsdM:编码限制性甲基化酶 hsds:编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年, Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind‖和HindⅢl

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割 分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA DNA的入侵 的入侵 细菌的限制与修饰作用 细菌的限制与修饰作用 hsd hsd R：编码限制性核酸内切酶 编码限制性核酸内切酶 hsd hsd MM：：编码限制性甲基化酶 编码限制性甲基化酶 hsd hsd SS：：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968 1968年，年，Smith Smith等人首先从流感嗜血杆菌 等人首先从流感嗜血杆菌dd株中分离出 株中分离出 Hind II Hind II和和Hind III Hind III

限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 1型 ‖型 型 限制修饰 多功能 单功 双功能 蛋白结构异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2SAM Mg ATP Mgz+ SAM 识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列 GAGCC AACNGGTGC CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型 限制修饰 限制修饰 多功能 多功能 单功能 单功能 双功能 双功能 蛋白结构 蛋白结构 异源三聚体 异源三聚体 同源二聚体 同源二聚体 异源二聚体 异源二聚体 辅助因子 辅助因子 ATP Mg ATP Mg2+2+ SAM SAM ATP Mg Mg Mg2+2+ ATP Mg2+2+ SAM SAM 识别序列 识别序列 TGAN TGAN88TGCT TGCT 旋转对称序列 旋转对称序列 GAGCC GAGCC AACN AACN66GTGC GTGC CAGCAG CAGCAG 切割位点 切割位点 距识别序列 距识别序列1kb 1kb处处 识别序列内或附近 识别序列内或附近 距识别序列下游 距识别序列下游 随机性切割 随机性切割 特异性切割 特异性切割 24-26bp 24-26bp处处

限制性核酸內切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名株名 Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株 Hindl dⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae aemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶

限制性核酸內切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR|的切割位点 EcoR|的识别序列 5∴ GCTGAATTCGAG∴..3 3∴ C GACTTAAGCTC∴.5

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 II II 型限制性核酸内切酶的基本特性 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8 对碱基的特定序列 对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构构 5‘ … G C T 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ C T T A A G C T C … 5’ EcoR I EcoR I的切割位点 的切割位点 EcoR I EcoR I的识别序列 的识别序列

EcoR等产生的5粘性末端 5∴ G-C-T-G-A-A-CGAG..3 3.cGAC-TA-A-GCTC∴.5 R|37C 5-C-T-G-OH P-A-A-T--C-G-A-G.3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-GCTC∴.5 退火47°C 5°. G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G∴3 3∴cGAC-TA- A G-C-T-C∴.5 P OH

EcoRI EcoRI等产生的 等产生的5‘ 5‘粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ -C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ -G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 EcoRI 37 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G- -C-T-G-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH P OH--G-C-T-C … 5’ G-C-T-C … 5’ 退火退火 4-7 4-7 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ -C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ -G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ OHOH PP PP OHOH

Pst等产生的3粘性末端 5∴GCTC=TG-0A-GGAG∴33 3C-G-A-G-A-C-GPT-C-C-T-C.5 Pst 37 C 5°.GCTC-TG-C-A-0H P-G-G-A-G∴3 3∴cGA-G-P OHA-C-G- I-C-C-T-C∴.53 退火47°C 5°∴ G-C-T-C--G-C- A G-G-A-G∴.3 3∴cGA-GA=C-G-CCTC∴.5 P OH

PstI PstI等产生的 等产生的3‘ 3‘粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 PstI 37 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A- -C-T-C-T-G-C-A-OH P OH P--G-G-A-G … 3’ G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G- -G-A-G-P OH P OH--A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火退火 4-7 4-7 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OHOH PP PP OHOH