华东理工大学：《基因工程》课程教学资源（课件讲稿）第九讲 外源基因表达产物的分离纯化

生物技术专业按心课程 基因工 华东理工大学张惠展

生物技术专业核心课程 生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学 张惠展 华东理工大学 张惠展

基因工程 1重组DNA技术与基因工程的基本概念 2重组DNA技术与基因工程的基本原理 3重组DNA技术所需的基本条件 4重组DNA技术的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6外源基因在大肠杆菌中的表达 7外源基因在酵母菌中的表达 8外源基因在哺乳动物细胞中的表达 9外源基因表达产物的分离纯化

基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组重组DNA DNA技术与基因工程的基本概念 技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理 技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件 技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化

9外源基因表达产物的分离纯化 A重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 B离子交换层析 C凝胶层析 D亲和层析 E膜分离 F原核生物表达的重组蛋白质量检测

D 亲和层析 9 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化 C 凝胶层析 B 离子交换层析 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 原核生物表达的重组蛋白质量检测 E 膜分离

9外源基因表达产物的分离纯化 A重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 ●合适分离纯化介质的选择 ●分离纯化过程的规模化

A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 9 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化 分离纯化过程的规模化

针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体; 采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶 菌酶处理,然后再用渗透压休克法释放重组蛋白

针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用采用分泌型战略表达重组蛋白 分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在 ，通常体积大、浓度低，因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用采用融合型战略表达重组蛋白 融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选 ，一般是胞内可溶性的，拟首先选 用亲和层析进行纯化 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白

针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域(p|≤5或p≥8)的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白; 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件,原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内(103-104mol/L); 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的; 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术,在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性

针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点 等电点处于极端区域（ 处于极端区域（pI pI≤5 ≤5 或或 pI pI≥8 ≥8）的重组蛋白应首选离子 ）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的 重组蛋白特异性的配体、底物 配体、底物、、抗体、糖链等都是首选亲合层析 抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件，原则是它们 纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内（10-8- 10 适的范围内（10-8- 10-4-4 mol / L mol / L）；）； 疏水层析 疏水层析和反相层析是根据蛋 和反相层析是根据蛋白质的 白质的疏水性差异进行分离的； 疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析 径向层析是近年来发展起来的 是近年来发展起来的集集层析分离和膜分离于一体的一种 层析分离 和膜分离于一体的一种 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性

多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时,通常需要综合使用多种技术,一般来 说,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: ●应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 ●应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 ●应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段

多种分离纯化技术的联合运用 多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来 常需要综合使用多种技术，一般来 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段

合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有 Sephadex和 Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质: 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 ●化学性能和机械性能稳定,重复性好 价格低廉

合适分离纯化介质的选择 合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex Sephadex和和Seperose Seperose。理想的分 。理想的分 离纯化介质应具有下列性质： 离纯化介质应具有下列性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉 价格低廉

分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适,如 ●实验室方法在工程上可能难以实现(超声波破细胞壁) ●实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心) 因此,在很多情况下,实验室的技术路线不等于生产工艺

分离纯化过程的规模化 分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适，如： 未必合适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺

9外源基因表达产物的分离纯化 B离子交换层析 离子交换层析的基本原理 ●离子交换介质的基本性质 ●离子交换介质的选择原则 ●离子交换层析的基本操作

B 离子交换层析 9 外源基因表达产物的分离纯化 外源基因表达产物的分离纯化 离子交换层析的基本原理 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则 离子交换介质的选择原则