《过氧化物酶活性的测定》实验讲义

实验二十二过氧化物酶活性的测定 、目的 过氧化物酶广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及 生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织 中活性较高,幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合 物转化成木质素,增加木质化程度,而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性増 加,N计信化物酯可佐如化的一轴片也出处计北物曰下酯在澧在玄础 中的 -CH HCH3 过氧化物酶 O-0 OH + 4H20 邻甲氧基苯酚 O-0 或与 O CH 氧化 其反 4一邻甲氧基苯酚(红棕色) 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值,即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.材料 水稻根系,马铃薯块茎等。 2.仪器 (1)分光光度计 (2)移液管 (3)离心机(4000r/min) (4)秒表 (5)研钵

实验二十二 过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及 生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织 中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合 物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增 加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种 中的重要作用也正在受到重视。 通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合 或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过 氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2 可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚， 其反应为： 红棕色的物质可用分光光度计在 470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1． 材料 水稻根系，马铃薯块茎等。 2． 仪器 （1）分光光度计 （2）移液管 （3）离心机（4 000r/min） （4）秒表 （5）研钵

(6)天平 3.药品 (1)0.1 mol/L Tris-HCI缓冲液(pH8.5) 取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加水稀释,用HCl调pH8.5后定容l000mL (2)0.2mo/L磷酸缓冲液(pH60) 贮备液A:0.2 mol/L Nah2PO溶液(27.8gNaH2PO4·H2O配成1000mL) 贮备液B:0.2mol/ L NazHPO4溶液(53.65 NachO4·7H2O或71.7 g NazHPC4·12H2O 配成1000mL)。 分别取贮备液A87.7mL与贮备液B123mL充分混匀并稀释至200mL。 (3)反应混合液 取0.2moL磷酸缓冲液(pH60)50mL,过氧化氢0.028mL,愈创木酚0.019mL混合 四、操作步骤 酶液提取:取不同水稻根系(根系表面水分吸干)1g,剪碎置于研钵中,加5mL0.1 mol/L Tris-HCI缓冲液(pH8.5),研磨成匀浆,以400r/min离心5min,倾出上清液,必要 时残渣再用5mL缓冲液提取一次,合并两次上清液,保存在冰箱(或冷处)备用。 2.取光径lcm比色杯2个,向其中之一加入上述酶液lmL(如酶活性过高可稀释之), 再加入反应混合液3mL,立即开启秒表记录时间:而向另一比色杯中加入02molL磷酸缓 冲液(pH6.0),作为零对照。用分光光度计在470m波长下测定反应5min时的光密度值 五、结果计算 以每分钟光密度变化(以每分钟 ODum变化001为1个活力单位)表示酶活性大小,即 △OD47m 过氧化物酶活力= n. mg(FW) 六、附注 1.酶的提取纯化需在低温下进行

（6）天平 3．药品 （1）0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.5） 取 12.114g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），加水稀释，用 HCl 调 pH8.5 后定容 1 000mL。 （2）0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 贮备液 A：0.2 mol/L NaH2PO4 溶液（27.8g NaH2PO4·H2O 配成 1 000mL）。 贮备液 B：0.2 mol/L Na2HPO4 溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O 或 71.7g Na2HPO4·12H2O 配成 1 000mL）。 分别取贮备液 A 87.7mL 与贮备液 B 12.3mL 充分混匀并稀释至 200mL。 （3）反应混合液 取 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）50mL，过氧化氢 0.028mL，愈创木酚 0.019mL 混合。 四、操作步骤 1．酶液提取：取不同水稻根系（根系表面水分吸干）1g，剪碎置于研钵中，加 5mL 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.5），研磨成匀浆，以 4 000r/min 离心 5min，倾出上清液，必要 时残渣再用 5mL 缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。 2．取光径 1cm 比色杯 2 个，向其中之一加入上述酶液 1mL（如酶活性过高可稀释之）， 再加入反应混合液 3mL，立即开启秒表记录时间；而向另一比色杯中加入 0.2 mol/L 磷酸缓 冲液（pH6.0），作为零对照。用分光光度计在 470nm 波长下测定反应 5min 时的光密度值。 五、结果计算 以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm变化0.01 为1 个活力单位）表示酶活性大小，即 过氧化物酶活力 = △OD470nm min·mg（FW） 六、附注 1．酶的提取纯化需在低温下进行

七、思考题 1.试述酶活力的定义? 2.测定酶的活力要注意控制哪些条件 参考答案 1.过氧化物酶活力是以每分钟光密度变化(ODm变化)001为1个活力单位来表示酶活 性大小的 2.酶的活力测定时:(1)保持待测材料的酶活:(2)测定时注意控制反应时间

七、思考题 1．试述酶活力的定义？ 2．测定酶的活力要注意控制哪些条件？ 参考答案 1．过氧化物酶活力是以每分钟光密度变化（OD470nm变化）0.01为 1个活力单位来表示酶活 性大小的。 2．酶的活力测定时：（1）保持待测材料的酶活；（2）测定时注意控制反应时间；