《微生物学实验》课程教学课件（PPT讲稿）实验二 革兰氏染色法和KOH法鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌

实验2革兰氏染色法 KOH法鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌 山东理工大学生命科学学院 微生物学教研组 2019.02

实验2 革兰氏染色法 KOH法鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌 山东理工大学生命科学学院 微生物学教研组 2019. 02 1

提纲 G也本罪)大爱 1.实验目的 2.实验原理 3.实验材料 4.实验步骤 5.注意事项

提纲 2 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验材料 4. 实验步骤 5. 注意事项

1、实验目的 的本翼工大置 学习并掌握细菌的革兰氏染色法及其原理； 了解KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌； 巩固显微镜油镜操作技术及无菌操作技术。 3

1、实验目的 3 • 学习并掌握细菌的革兰氏染色法及其原理； • 了解KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌； • 巩固显微镜油镜操作技术及无菌操作技术

2、实验原理 G也本R)大罩 什么是革兰氏染色法？ ◆细菌经过 初染-媒染-脱色-复染 紫 红 ◆如果细菌细胞不被脱色而保留初染紫颜色者， 称为革兰氏阳性菌(G+), ◆若被脱色，而染上复染剂的红颜色者，称为革 兰氏阴性菌(G·)。 ◆问题：为什么两类细菌染色结果不同？

2、实验原理 4 什么是革兰氏染色法？ ◆细菌经过 初染-媒染-脱色-复染 紫 红 ◆如果细菌细胞不被脱色而保留初染紫颜色者， 称为革兰氏阳性菌（G+）， ◆若被脱色，而染上复染剂的红颜色者，称为革 兰氏阴性菌（G－）。 ◆问题：为什么两类细菌染色结果不同？

2、实验原理 出本翼2大军 革兰氏染色反应的机制： 细胞壁结构和组成的差异 )G细菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高、层次多、交联紧密，无类脂 脱色时失水网孔缩小，初染的结晶紫碘复合物留在壁内（紫色），复染后呈紫 红色。 b)G细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量低、层次少、交联疏松，有类脂外膜 脱色时类脂外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖层不能阻挡结晶紫碘复合物的溶 出，脱色后退为无色，复染后呈现红色

2、实验原理 革兰氏染色反应的机制： 细胞壁结构和组成的差异 a) G+细菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高、层次多、交联紧密，无类脂 脱色时失水网孔缩小，初染的结晶紫-碘复合物留在壁内（紫色），复染后呈紫 红色。 b）G-细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量低、层次少、交联疏松，有类脂外膜 脱色时类脂外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖层不能阻挡结晶紫-碘复合物的溶 出，脱色后退为无色，复染后呈现红色

2、实验原理 G也本罪)大爱 KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌原理： 细胞壁结构和组成的差异 a)G细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量少，脂多糖含量高，遇KOH溶液时，细胞裂解释放 出DNA。DNA和蛋白质、脂多糖复合物遇KOH形成粘稠的胶冻状物，可以拉出粘丝状。 b)G+细菌：细胞壁厚、肽聚糖含量多、无类脂，细胞壁坚固，遇KOH溶液无反应

2、实验原理 KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌原理: 细胞壁结构和组成的差异 a） G- 细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量少，脂多糖含量高，遇KOH溶液时，细胞裂解释放 出DNA。DNA和蛋白质、脂多糖复合物遇KOH形成粘稠的胶冻状物，可以拉出粘丝状。 b ） G+细菌：细胞壁厚、肽聚糖含量多、无类脂，细胞壁坚固，遇KOH溶液无反应

3、实验材料 的本翼工大写 >材料大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养16的菌液，斜面或固体平板。 >试剂革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液 等)，香柏油（或液体石蜡），二甲苯（或乙醚：乙醇=7：3），无菌水、 30 g/L KOH >器具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 7

3、实验材料 7 ➢ 材料 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养16 h的菌液, 斜面或固体平板。 ➢ 试剂 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液 等），香柏油（或液体石蜡），二甲苯（或乙醚：乙醇=7:3），无菌水、 30 g/L KOH； ➢ 器具 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯

4、实验步骤-革兰氏染色 G中本用)大罩 ·1制片（涂片、干燥、固定) ·2初染1-2min结晶紫 (水洗) ·3媒染 1min碘液 (水洗) 。4 脱色 20-30S乙醇 (水洗) ·5复染 2min番红 (水洗干燥) ·6镜检油镜

4、实验步骤-革兰氏染色 8 • 1 制片 （涂片、干燥、 固定） • 2 初染 1-2min 结晶紫 （水洗） • 3 媒染 1min碘液 （水洗） • 4 脱色 20-30S 乙醇 （水洗） • 5 复染 2min番红 （水洗 干燥） • 6 镜检 油镜

4、实验步骤-革兰氏染色 制片（参考实验书P38) ·涂片 固定 ·干燥 ·固定 涂片 ·杀死细菌，固定细胞形态。 ·使菌体粘附于坡片上。 ·增加细菌对染料的亲和力。 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种。 9

4、实验步骤-革兰氏染色 9 制片（参考实验书P38） • 涂片 • 干燥 • 固定 • 杀死细菌，固定细胞形态。 • 使菌体粘附于坡片上。 • 增加细菌对染料的亲和力。 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种

4、实验步骤-革兰氏染色 中东理工大等 革兰氏染色 固定 初染 染色步骤 水洗 涂片 初染 1-2min结晶紫 媒染 1-2min碘液 脱色 20-30S乙醇 媒染 水洗 脱色 水洗 复染 复红2-3min 染色结果：G+细菌 紫红色 复染 干燥 G细菌 红色 水洗 镜检 注意初染、媒染、脱色及复染后都需要水洗。复染水洗后需要干燥才可以镜检（吸水纸吸干、自然晾干或冷风 吹干)

4、实验步骤-革兰氏染色 10 革兰氏染色 染色步骤： 初染 1-2min 结晶紫 媒染 1-2min碘液 脱色 20-30S乙醇 复染 复红 2-3min 染色结果： G+细菌 紫红色 G- 细菌 红色 注意初染、媒染、脱色及复染后都需要水洗。复染水洗后需要干燥才可以镜检（吸水纸吸干、自然晾干或冷风 吹干）