吉林大学基础医学院：实验教学中心（教案讲义）无菌操作技术及注意事项

无菌操作技术及注意事项 1、玻璃器皿的消毒和清洁 (①)新购玻璃器皿的处理 新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%一2%盐酸溶液浸泡，以除去游 离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐 酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 (2)污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%~ 5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清 水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 ②细培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kgcm2高压灭菌15~30分钟，再用热 水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸 馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃ 烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 同染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般 染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然 冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备 将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包 好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2 小时，取出备用。 对于手术器械 、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即 在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G滤 器负压抽滤后使用

无菌操作技术及注意事项 1、玻璃器皿的消毒和清洁 ⑴新购玻璃器皿的处理 新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用 1％～2%盐酸溶液浸泡，以除去游 离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐 酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 ⑵污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用 3％煤酚皂溶液或 5％石炭酸浸泡，再煮沸 30 分钟，或在 3％～ 5％漂白粉澄清液内 4 小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清 水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 ②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用 1kg/cm2 高压灭菌 15～30 分钟，再用热 水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于 3%煤酚皂溶液中浸泡 24 小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸 馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃ 烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般 染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于 3％煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然 冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备 将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包 好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于 120℃的干燥箱中干燥灭菌２ 小时，取出备用。 对于手术器械 、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即 在 15 磅的条件下，加热 20 分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤 器负压抽滤后使用

3、无菌操作过程 在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20~30 分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿 无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用 酒精灯烧烤之后再吸液体。 4、常用清洁液的配制法 ()重铬酸钾清洁液： 可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。 配方 2 3 4 重铬酸钾(g) 80 60 200 60 100 粗浓硫酸(ml) 100 90 500 460 800 水(ml) 1000 750 500 300 200 先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。 重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变 质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再加入少量重铬酸钾及浓硫酸，还可 继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。 配制重铬酸钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸塘瓷或塑料容器，使用玻璃器皿时， 应特别注意防止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。 (2碳酸三钠将其配成5%~10%水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用 腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 (③)硝酸清洁液将其配成50%水溶液，可用于清洁微量滴定筒。 (4)乙二胺四乙酸二钠(EDTA钠盐)将其配成5%~10%水溶液，可洗脱粘附于玻璃 器皿内壁的白色沉淀物。 (⑤)尿素溶液尿素是溶解蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤粘附有血液血清等蛋白质的吸 管、试管等

3、无菌操作过程 在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前 20～30 分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿 无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在 开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后 1/3 处，戴上胶皮乳头，并用 酒精灯烧烤之后再吸液体。 4、常用清洁液的配制法 ⑴重铬酸钾清洁液： 可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。 配 方 1 2 3 4 5 重铬酸钾（g） 80 60 200 60 100 粗浓硫酸（ml） 100 90 500 460 800 水（ml） 1000 750 500 300 200 先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。 重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变 质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再加入少量重铬酸钾及浓硫酸，还可 继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。 配制重铬酸钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿时， 应特别注意防止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。 ⑵磷酸三钠 将其配成 5％～10％水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用 腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 ⑶硝酸清洁液 将其配成 50％水溶液，可用于清洁微量滴定筒。 ⑷乙二胺四乙酸二钠（EDTA 钠盐） 将其配成 5％～10%水溶液，可洗脱粘附于玻璃 器皿内壁的白色沉淀物。 ⑸尿素溶液 尿素是溶解蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤粘附有血液血清等蛋白质的吸 管、试管等