吉林大学基础医学院：实验教学中心（PPT讲稿）淋巴细胞转化试验

系统实验之二 T淋巴细胞功能测定 付海英 fuhaiying612@yahoo.com.cn

系 统 实 验 之 二 T淋巴细胞功能测定 付海英 fuhaiying612@yahoo.com.cn

实验组 对照组 OVA(1mg/ml+CFA免疫小 生理盐水(500l)免疫 鼠腹腔内注射500川 小鼠腹腔内注射 实验流程 OVA+CFA加强免疫 生理盐水加强免疫小 小鼠500μl① 鼠500μl① After 1W 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 1.双向免疫扩散试验③ 分离血清② 抗体效价 2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④ 增殖功能 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验②

实 验 流 程 1W 1.双向免疫扩散试验③ 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) ④ OVA (1mg/ml)+CFA免疫小 鼠腹腔内注射500 µl OVA+CFA加强免疫 小鼠500 µl ① 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 分离血清② 2W 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验② 生理盐水（500 µl )免疫 小鼠腹腔内注射 生理盐水加强免疫小 鼠500 µl ① 2W After 1W 实验组 对照组 抗体效价 增殖功能

实验内容 合小鼠摘眼球取血、 分离血清 一淋巴细胞转化试验

实验内容  小鼠摘眼球取血、 分离血清  淋巴细胞转化试验

教学要求 掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验 的基本原理及基本操作

教学要求 ❖ 掌握小鼠血清的分离 ❖ 掌握淋巴细胞转化试验 的基本原理及基本操作

淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) 原理 。检测方法 操作步骤 。应用

淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) ❖ 原理 ❖ 检测方法 ❖ 操作步骤 ❖ 应用 原理 Lymphocytes(B/T) Mitogens Specificity Ag Proliferation Transformation Lymphoblast Nucleic Acid↑ Protein ↑ 检测方法 ◼◼ 形态学方法 ◼◼ 33HH-TdR掺入法 ◼◼ MTT MTT法法 ((本次实验采用)) 形态学方法 ◼◼ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细 胞的胞的33-44倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并 形成空泡。 ◼◼ 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和 核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、 过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细 胞胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200 200个细胞， 按下式计算转化率： 100%      + = 转化的淋巴细胞数 未转化的淋巴细胞数 转化的淋巴细胞数 转化率 33HH-TdR掺入法 G0G0 G1G1 有 丝 分裂 原 特 异 性抗 原 SS Pr,RNA,D NA 前 体 物质 DNA↑↑ New DNA 3H-T dR 3 TdR 3HH-TdR cpm 对照管 值 刺激管 值 cpm ConA cpm SI = MTT法 活活 / /增殖增殖 期的细胞 线粒体 能 量 代谢 琥珀酸脱氢酶 MTT MTT MT T MT T掺入掺入 还还 原原 甲甲臜臜颗粒颗粒 formazan 细胞内 / 测测AA值值 溶解溶解 /周围周围 对照管 值 刺激管 值 A ConA A SI = 操 作 步 骤 1W 1.双向琼脂扩散试验 2.酶联免疫吸附试验（ E LISA） 1.1.双向琼脂扩散试验 2.2.酶联免疫吸附试验（ E LISA）） OVA OVA免疫免疫//生理盐水 无菌取脾 /胸腺 研 磨 成单 细胞 悬液 (1/ 2脾 /胸 腺 +2ml IM DM（无 FCS) 无菌取脾 /胸腺 研 磨 成单 细胞 悬液 (1/ 2脾 /胸 腺 +2ml IM DM（无 FCS) 摘眼取血 获取血清 细胞计数 【?/ ml】 取 20µ l细胞 +980µ l的计 数液 细胞计数 【?/ ml】 取 20µ l细胞 +980µ l的计 数液 加板 (三复 孔 ) (加 法 见附 图 ) 加板 (三复 孔 ) (加 法 见附 图 ) 调细胞浓度 ?/ ml× A=1.5× 1× 107 调细胞浓度 ?/ ml× A=1.5× 1× 107 37℃ 5%C O 2 培养 48小时 37℃ 5%C O 2 培养 48小时 培 养 终止 前 2小 时加 入 MTT (5mg / ml ) 1 0µ l/ well 培 养 终止 前 2小 时加 入 MTT (5mg / ml ) 1 0µ l/ well 37℃ 5% C O2 继 续 培养 2小时 37℃ 5% C O2 继 续 培养 2小时 2000rp m 5min 2000rp m 5min 小 心 弃去 上清 ，加 入 100µ l/ 孔 DMS O振 荡 ， 使颗 粒全 部溶 解 小 心 弃去 上清 ，加 入 100µ l/ 孔 DMS O振 荡 ， 使颗 粒全 部溶 解 酶 标 仪测 吸光 度值 ： A570n m 结 果 判定 ： 结 果 判定 ：SI= SI=Co n A Co n A孔孔AA值值//对 照孔 对 照孔AA值值 淋巴细胞转化试验的应用 ◼◼ 检查患者细胞免疫功能 ◼◼ 估计疾病的疗效及预后 ◼◼ 细胞配型抗原的检查：移植免疫 ◼◼ 免疫药理学：具有免疫调节的药物、 保健品、中草药及生物制品 ◼◼ 卫生毒理学的研究

实验分组及材料 分组：每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏 器材 12.酶标仪 1. 酒精棉球 若干 13.离心机 2个/r00m 2. 无菌纱布块 1块/组 14.超净台 2个/room 3. 无菌平皿 1块/组 4. 无菌吸头（大、中、小）4盒room 动物及试剂 5.无菌96孔培养板 1块/组 1.小鼠 2只/阻NS,0V) 2.培养液(IMDM无FCS 100ml/room 6. 可调微量加样器 4套/room 3.培养液(IMDM20%FCS30ml/room 7。细胞计数板 1套/组 4.ConA(2.5,5,10μg/ml) 各1.5ml/tube 8。显微镜 1台/组 5. 白细胞计数液(2%冰醋酸)2瓶r0om 9.EP管 若干 6. MTT (5mg/ml) 1.5ml/room 10.眼科剪、小镊子 4套/room 7.二甲亚砜(DMSO) 5mlV组 11.细胞培养箱(37℃5%C0)

实验分组及材料 ❖ 器材 1. 酒精棉球 若干 2. 无菌纱布块 1块/组 3. 无菌平皿 1块/组 4. 无菌吸头（大、中、小）4盒/room 5. 无菌96孔培养板 1块/组 6. 可调微量加样器 4套/room 7. 细胞计数板 1套/组 8. 显微镜 1台/组 9. EP管 若干 10. 眼科剪、小镊子 4套/room 11. 细胞培养箱（37℃5%CO2 ) 12. 酶标仪 13. 离心机 2个/room 14. 超净台 2个/room ❖ 动物及试剂 1. 小鼠 2只/组(NS,OVA) 2. 培养液（IMDM)无FCS 100ml/room 3. 培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room 4. ConA（2.5,5,10µg/ml) 各1.5ml/tube 5. 白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room 6. MTT（5mg/ml) 1.5ml/room 7. 二甲亚砜（DMSO) 5ml/组 分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏

免疫血清分离过程 摘眼球取血 RT for 2hrs 1.5ml EP Double Rotation diffusion 3000rpm for 20min Transfer serum to a new EP : ELISA

免疫血清分离过程 摘眼球取血 RT for 2hrs Rotation 3000rpm for 20min Transfer serum to a new EP Double diffusion Store at 4℃ ELISA 1.5ml EP

实验步骤 单细胞悬液的制备： 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾和胸腺组织（各1/2），分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。 3. 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻 压组织，将其捣碎。然后用1000加样器隔着纱布将细胞悬液吸 出，放入1.5mlEP管中。 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20，加到盛有980计数液 的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。 2.调细胞浓度至1×107/ml,所需量为1.5ml,设需要的细胞悬液体 积为Aml,可按公式：？/ml×A=1.5×1×107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准

实验步骤 ❖ 单细胞悬液的制备： 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。 3. 将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻 压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸 出，放入1.5ml EP管中。 ❖ 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液 的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体 积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107 NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准

) 细孢计数板 深0.1mm 1.0nm ① 1.0mm 查出四个大方格的总细胞数X 算出每个大方格的细胞数：Y=XV4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=104ml 制备的细胞悬液的细胞浓度(/ml)-Y×104×稀释倍数(50)

细胞计数板 ❖ 查出四个大方格的总细胞数(X) ❖ 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 ❖ 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml ❖ 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50) 4

细胞培养： 1. 按图所示加板。 2.将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%C02培养箱 中，培养48小时。 MTT掺入：（隔一天下午2：00） 1. 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 2.每孔内加入MTT(5mg/ml)10l,加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混 匀。 3. 在37℃5%c02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm,5min, 轻轻弃去上清，（注意不要将孔低部的颗粒物弃出）。 4 加入100l二甲亚砜(DMS0),将颗粒溶解。（匾二天下午4：00）】 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零)，记录 结果。 2. 结果判定：SI(刺激指数)=ConA刺激孔A值/对照孔A值

❖ 细胞培养： 1. 按图所示加板。 2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱 中，培养48小时。 ❖ MTT掺入：（隔一天下午2:00） 1. 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 2. 每孔内加入MTT（5mg/ml) 10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混 匀。 3. 在37℃ 5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min， 轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。 4. 加入100µl 二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午4:00） ❖ 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录 结果。 2. 结果判定： SI（刺激指数）=Con A刺激孔 A值 / 对照孔A值