吉林大学基础医学院：实验教学中心（PPT讲稿）SRY基因的检测

SRY基因的检测 目的要求 掌握PCR反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用PCR扩增检测性别的方法 掌握用PCR扩增检测性别方法的应用

SRY基因的检测 目的要求 掌握PCR反应的基本原理 掌握性别决定的分子机制 掌握用PCR扩增检测性别的方法 掌握用PCR扩增检测性别方法的应用

原理 1聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)的基本原理是，通过 热变性使目的DNA(模板DNA)双链解 开；通过退火将引物复性结合到它们 的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物 反复循环体外扩增出大量一对引物之 间的DNA片段

原理 ◼ 1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过 热变性使目的DNA（模板DNA）双链解 开；通过退火将引物复性结合到它们 的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物， 反复循环体外扩增出大量一对引物之 间的DNA片段

聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction (PCR) 一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术

◼聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction （PCR） 一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术

染色体 P(R可以把指定的基因片段数量放大 百万倍

PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大 百万倍 染色体 Mullis (1993)

PCR基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一 树分别与模板3？和5？端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的 作用下，按照半保留复制的机制延 模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段 得以扩增

PCR基本工作原理 ◼以拟扩增的DNA分子为模板，以一 对分别与模板3’和5’端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的 作用下，按照半保留复制的机制延 模板链延伸直至完成新的DNA合成。 ◼重复这一过程，可使目的DNA片段 得以扩增

P℃R林系基本组成成芬 棋板DNA 扩增片段 ●模板DNA ○特异性引物 ●一对分别与待扩增DNA序列两端互 补的寡核苷酸片段。 耐热DNA聚合酶 ●Tag DNA聚合酶 dNTPs ●含Mg2+的缓冲液

PCR体系基本组成成分 ⚫含Mg2+的缓冲液 ⚫dNTPs ⚫耐热DNA聚合酶 ⚫Tag DNA聚合酶 ⚫特异性引物 ⚫一对分别与待扩增DNA序列两端互 补的寡核苷酸片段。 ⚫模板DNA 模板DNA 基因组DNA DNA样品 待扩增片段

PR基寒反应步骤 三个步骤为一个循环， 使模板DNA完全变性成单链。 每次循环产物作为下一 同时引物自身和引物之间存在 轮模板进入下一轮循环 的局部双链得以消除 变性 使引物和模板 此温度下DNA 95°C DNA退火结合 聚合酶以dNTP 为底物催化 DNA链的延长 循环 25-30 延伸 次 退火 72°C Tm-5°

PCR基本反应步骤 变性 95˚C 延伸 72˚C 退火 Tm-5˚C 循环 25-30 次 使模板DNA完全变性成单链。 同时引物自身和引物之间存在 的局部双链得以消除 使引物和模板 此温度下DNA DNA退火结合 聚合酶以dNTP 为底物催化 DNA链的延长 三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一 轮模板进入下一轮循环

必过 第一轮循环 延伸(72℃) DNA-POl5/ 53 35 C50505060305050 5/ DNA-Pol 温度

第一轮循环 5 / 3 / 3 / 5 / 5/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 变性（95℃） 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 退火（60℃） 延伸（72℃） DNA-Pol DNA-Pol 温度

0 5/ 引物B 第二轮循环 延伸(72℃) DNA-Pol 5/ 3/ CS05507万 5 DNA-Pol DNA-POI5/ 060505050 5 DNA-Pol 温度

第二轮循环 5/ 5/ 5 / 3 / 3 / 5 / 5/ 5/ 引物A 引物B 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 5/ 5/ 5/ 5/ 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol

弟二次循环 延伸(72℃) DNA-Pol DNA-Pol 5 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol C50505066305050 DNA-Pol DNA-Pol 温度

第三次循环 5 5 / / 5 / 5 / 5 / 5 / 5 / 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 5 / 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol