复旦大学:《细胞与医学遗传学实验》教学课件_细胞损伤与保护实验(三)凋亡相关基因-Bax 在不同细胞中表达产物差异检测
细胞损伤与保护实验(三) 凋亡相关基因-Bax 在不同细胞中表达产物差异检测
凋亡相关基因-Bax 在不同细胞中表达产物差异检测 细胞损伤与保护实验(三)
原理 免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其所带有 的特殊标记物的显示,籍以对细胞内某抗原或抗 体作定性、定位以及定量检测 亲和组织化学:则将一些具有双价或多价结 合力的物质(生物素),应用于免疫组化,使得抗原 抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高 灵敏性和高特异性
原 理 免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其所带有 的特殊标记物的显示,籍以对细胞内某抗原或抗 体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学:则将一些具有双价或多价结 合力的物质(生物素),应用于免疫组化,使得抗原 抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高 灵敏性和高特异性
原理 Bax ■凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变(寡聚化) 作用线粒体膜,使其膜通透性增加,释放 Cytc,细胞凋亡
原 理 Bax—— ◼ 凋亡相关基因 ◼ Bcl-2家族成员 ◼ 细胞损伤时其蛋白构象发生改变(寡聚化) ◼ 作用线粒体膜,使其膜通透性增加,释放 Cytc,细胞凋亡
原理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原,用小 鼠特异性抗体(一抗)与其结合,再用生 物素标记的羊抗小鼠抗体(二抗)与前者 结合,形成了生物素复合物 此复合物与SABC作用,使得检测物被 放大,最后在显色剂DAB的作用下,Bax构 象蛋白显色(褐色)
原 理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原,用小 鼠特异性抗体(一抗)与其结合,再用生 物素标记的羊抗小鼠抗体(二抗)与前者 结合,形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用,使得检测物被 放大,最后在显色剂DAB的作用下,Bax构 象蛋白显色(褐色)
器材与试剂 仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、 SABC、DAB、0.3%H2O2-PBS
器材与试剂 仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3%H2O2 -PBS
试剂说明 PBS:磷酸盐缓冲液(0.01Mp74) 时闭液:山羊血清(或BSA),用时PBS稀释 抗:小鼠gG,用时PBS稀释 抗:生物素标记的羊抗小鼠IgG 0.3%H2O2-PBS(甲醇) 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC( avidin- biotin- peroxidase complex链酶亲和素 生物素——过氧化物酶复合物): 抗生物素,起到放大作用 DAB( diaminobenzidine)显色液: 3,3′-二氨基联苯胺
试 剂 说 明 ◼ PBS: 磷酸盐缓冲液( 0.01M pH7.4 ) ◼ 封闭液: 山羊血清(或BSA),用时PBS稀释 ◼ 一 抗: 小鼠IgG,用时PBS稀释 ◼ 二抗: 生物素标记的羊抗小鼠IgG ◼ 0.3% H2O2 -PBS(甲醇) 消除内源性过氧化物酶活性作用 ◼ SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 ——生物素——过氧化物酶复合物) : 抗生物素,起到放大作用 ◼ DAB(diaminobenzidine)显色液: 3,3´-二氨基联苯胺
实验步骤 ■培养细胞(96孔板,每组3正常、3损伤、3损伤恢复) PBS洗,5minX3次(轻轻地洗涤) ■甲醇固定10min ■PBS洗,5minX3次 加入封闭液(1:10)25l,37℃,30min 加一抗(1:30025,37℃,1h(或4C过夜) PBS洗,5minX3次 加二抗(1 mI Pbs加入生物素化山羊抗小鼠IgG10) 25{,37℃,1h ■PBS洗,5minx3次
实验步骤 ◼ 培养细胞(96孔板,每组3正常、3损伤、3损伤恢复) ◼ PBS洗,5min X 3次 (轻轻地洗涤) ◼ 甲醇固定10min ◼ PBS洗,5min X 3次 ◼ 加入封闭液(1:10) 25µl,37 ℃,30min ◼ 加一抗(1:300)25µl,37℃,1h (或4℃过夜) ◼ PBS洗,5min X 3次 ◼ 加二抗(1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10µl) 25µl,37 ℃,1h ◼ PBS洗,5min X 3次
实验步骤 加0.3%H2O2-PBS(甲醇),37℃,30min PBS洗,5minx3次 SABC工作液(1 mI PBs加入SABC10,混匀)20 30μl,37℃,1h PBS洗,5min3次 DAB显色 DAB显色工作液配制(现配):1ml蒸馏水,加试 剂盒中A、B、C试剂各一滴,混匀后加至细胞孔 板,镜下控制,以蒸馏水终止反应 观察结果
实验步骤 ◼ 加0.3% H2O2 -PBS(甲醇),37 ℃,30min ◼ PBS洗,5min X 3次 ◼ SABC工作液(1ml PBS加入SABC 10µl,混匀)20- 30µl,37 ℃,1h ◼ PBS洗,5min X 3次 ◼ DAB显色: DAB显色工作液配制(现配):1ml蒸馏水,加试 剂盒中A、B、C试剂各一滴,混匀后加至细胞孔 板,镜下控制,以蒸馏水终止反应。 ◼ 观察结果
实验结果 缺糖前Hela细胞
实验结果 缺糖前 Hela 细胞
缺糖24 n hela细胞
缺糖 24h Hela细胞
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