复旦大学：《细胞与医学遗传学实验》教学课件_遗传病的分析——人类淋巴细胞培养和染色体标本的制备

LOGO 遗传病的分析3 人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备

LOGO 人类淋巴细胞培养 和染色体标本的制备 遗传病的分析3

原理 在细胞的生长周期中,中期染色体的长短、 大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研 究 因此利用人工的方法,使大部分分裂细胞处 于中期而不向后期转化,并获得之,经处理, 制片后观察分析

原 理 ▪ 在细胞的生长周期中，中期染色体的长短、 大小、恒定性正适合我们对其进行分析、研 究。 ▪ 因此利用人工的方法，使大部分分裂细胞处 于中期而不向后期转化，并获得之，经处理， 制片后观察分析

器材与试剂 器材 人外周血5ml。 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天 平等 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰 载玻片等

器材与试剂 器材 ： ▪ 人外周血5ml。 ▪ 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天 平等。 ▪ 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰 载玻片等

器材与试剂 试剂: 肝素 含10%小牛血清RPM1640 植物血凝素(PHA) 秋水仙素(5微克/毫升) 0.075MKCl, 固定液(甲醇/冰乙酸3:1) Giemsa染液

器材与试剂 试剂： ▪ 肝素 ▪ 含10%小牛血清RPMI1640 ▪ 植物血凝素（PHA） ▪ 秋水仙素（5微克/毫升） ▪ 0.075MKCl， ▪ 固定液（甲醇/冰乙酸3:1） ▪ Giemsa染液

操作 1、采血:取血3-5m1,肝素抗凝。 2、接种:5m培养液中加入0.3-0.5m全血并摇匀, 每份血样接种2瓶,置37℃,培养72h 3、秋水仙素处理:终止培养前1.5-2h加秋水仙素 (终浓度为0.07ugm1),混匀,37℃继续培养。 4、收集细胞:将培养细胞混匀吸入刻度离心管(2 瓶培养物吸入1支刻度离心管内),1500r/min离 心,10min。 5、低渗处理:弃上清,加8m0.075MKC1溶液,混 匀,置37℃水浴20min

操 作 1、采血： 取血3-5ml,肝素抗凝。 2、接种： 5ml培养液中加入0.3-0.5ml全血并摇匀， 每份血样接种2瓶，置37℃,培养72h。 3、秋水仙素处理：终止培养前1.5-2h加秋水仙素 （终浓度为0.07 ug/ml），混匀，37℃继续培养。 4、收集细胞 ：将培养细胞混匀吸入刻度离心管（2 瓶培养物吸入1支刻度离心管内），1500r/min离 心，10min。 5、低渗处理：弃上清，加8ml 0.075M KCl溶液，混 匀，置37℃水浴20min

操作 6、预固定:低渗处理后,加1m固定液混匀, 5min后1500r/min离心,10min 7、固定:弃上清,加8m固定液,混匀,室温静置 30min,1500r/min离心,10min 8、再固定:同上(省略)。 9、制备细胞悬液:弃上清,视细胞数量多少加适 量固定液制成细胞悬液。 10、制片:取细胞悬液2-3滴,滴于冰玻上,并迅 速吹片,酒精灯火焰烤干 11、观察: Giemsa染色,5min,自来水冲洗,镜 检

操 作 6、预固定 ：低渗处理后，加1 ml固定液混匀， 5min后1500r/min离心，10min。 7、固定 ：弃上清，加8 ml固定液，混匀，室温静置 30min，1500r/min离心， 10min。 8、再固定 ：同上（省略）。 9、制备细胞悬液 ：弃上清，视细胞数量多少加适 量固定液制成细胞悬液。 10、制片 ：取细胞悬液2-3滴，滴于冰玻上，并迅 速吹片，酒精灯火焰烤干。 11、观察： Giemsa染色，5min，自来水冲洗，镜 检

结果 光镜100倍下人染色体G带照片

结 果 光镜100倍下人染色体G带照片

注意事项 ■培养温度应严格控制在37℃±0.5℃。 培养液的pH值7.4±0.1,偏酸细胞发育不良,偏 碱则细胞出现轻度固缩。 PHA的质量和浓度很关键,它对淋巴细胞的刺激效 应有个体差异较大。(肝素) ■秋水仙素一般最终浓度以0.04-0.08ug为宜,处理 时间为1-4h ■低渗的浓度与时间应掌握好。 固定液应临用时新鲜配制,固定时一定要彻底打 匀

注意事项 ▪ 培养温度应严格控制在37℃±0.5℃。 ▪ 培养液的pH值7.4±0.1，偏酸细胞发育不良，偏 碱则细胞出现轻度固缩。 ▪ PHA的质量和浓度很关键，它对淋巴细胞的刺激效 应有个体差异较大。 （肝素） ▪ 秋水仙素一般最终浓度以0.04-0.08ug为宜，处理 时间为1-4h。 ▪ 低渗的浓度与时间应掌握好。 ▪ 固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底打 匀