复旦大学：《细胞与医学遗传学实验》教学课件_遗传病的分析——DNA扩增产物的鉴定

遗传病的分析5 DNA扩增产物的鉴定

遗传病的分析5 DNA扩增产物的鉴定

限制性内切酶酶切技术 琼脂糖凝胶电泳技术

限制性内切酶酶切技术 琼脂糖凝胶电泳技术

限制性内切酶酶切技术

一、限制性内切酶酶切技术

原理 限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化 得到,能特异性识别和切割双链DNA分子 中的特异序列(一般识别4-6个核苷酸序 列) 由于大多数内切酶具绝对的位点特异性 因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物 通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷

原 理 ▪ 限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化 得到，能特异性识别和切割双链DNA分子 中的特异序列（一般识别4－6个核苷酸序 列） ▪ 由于大多数内切酶具绝对的位点特异性， 因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物， 通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷

原理 本实验使用限制性内切酶(LweI), 酶切位点: 5… GCATC(N)5…3 3..CGTAG(N)9T.5 正常人样品具有酶切位点,能够被酶切开, 分成2个片断;而病人组G则被A替代,酶切 位点丧失,不能被酶所切动,所以还是1个 片断

原 理 本实验使用限制性内切酶（Lwe I） ， 酶切位点： 5′….GCATC(N)5↓…3′ 3′….CGTAG(N)9↑….5′ 正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开， 分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切 位点丧失，不能被酶所切动，所以还是１个 片断

器材与试剂 高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、 枪头、塑料离心管等 Lwe限制性内切酶、三蒸水、缓冲 液等

器材与试剂 ▪ 高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、 枪头、塑料离心管等 ▪ Lwe I限制性内切酶、三蒸水、缓冲 液等

操作 1、取样品2份(病人、正常人PCR扩增产物) 无菌ddH2o14ul 缓冲液10×2ul 扩增产物35u 20u混匀 内切酶 0.5ul 2、置370C水浴3h(或过夜)

操 作 1、取样品2份（病人、正常人PCR扩增产物） 无菌ddH2O 14ul 缓冲液10× 2ul 扩增产物 3.5ul 内切酶 0.5ul 2、置37oC水浴3h（或过夜） 20ul混匀

注意事项 内切酶需在一20°C环境中保存 内切酶活性的发挥需要Mg2+。 为使酶反应时达到最佳条件,需使用生产 厂商提供的反应条件或缓冲液

注意事项 ▪ 内切酶需在－20℃环境中保存。 ▪ 内切酶活性的发挥需要Mg2＋ 。 ▪ 为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产 厂商提供的反应条件或缓冲液

、琼脂糖凝胶电泳技术

二、琼脂糖凝胶电泳技术

原理 溴化乙啶(EB)是一种高度灵敏的荧光染色剂, 用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,可用带 CCD摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。 一定量的DNA加入琼脂糖凝胶,能与凝胶中的EB 结合,在TAE介质溶液中,进行电泳。由于电场 作用,DNA分子会从负极向正极泳动,分子量小 的泳动在前,大的在后,形成不同的DNA条带。 此时用紫外透射仪可以检测之。 以标准Make为参照物,可以得知被检DNA的大

原 理 ▪ 溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂， 用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带 CCD 摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。 ▪ 一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB 结合，在TAE介质溶液中，进行电泳。由于电场 作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小 的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。 此时用紫外透射仪可以检测之。 ▪ 以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大 小