复旦大学：《细胞与医学遗传学实验》教学课件_遗传病的分析——基因组DNA提取与PCR扩增技术

遗传病的分析4 基因组DNA提取与PCR扩增技术

遗传病的分析4 基因组DNA提取与PCR扩增技术

、基因组DNA提取

一、基因组DNA提取

实验目的 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 ·本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方 法

实验目的 • 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 • 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方 法

原理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形 式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子 键、氢键、范德华力等,破坏或降低这些结合力 就可把核酸与蛋白分开 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭 双键具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在260nm 处,所以,可用紫外分光光度法测定DNA的浓度

原 理 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形 式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子 键、氢键、范德华力等，破坏或降低这些结合力 就可把核酸与蛋白分开。 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭 双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm 处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度

原理 基因组DNA提取试剂盒:在高盐的状 态下,DNA纯化树脂专一性地吸附DNA 而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下 来

原理 基因组DNA提取试剂盒：在高盐的状 态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA； 而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下 来

器材与试剂 台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移 液枪、塑料离心管等 ·试剂盒(纯化树脂、GN结合液、漂洗液、 无水乙醇、离心纯化柱)、TE缓冲液

器材与试剂 • 台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移 液枪、塑料离心管等 • 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、 无水乙醇、离心纯化柱 ）、TE缓冲液

操作 1、将全血轻轻混匀,转移0.5m全血到1m纯化树脂中, 颠倒混匀5-6次,室温,3min。其间要颠倒混匀1次, 5000/min离心×3sec; 2、取沉淀,加1mGN结合液悬浮沉淀,颠倒混匀, 5000/mn离心×3seC; 3、取沉淀,加0.5m漂洗液纯化树脂2次,颠倒混匀, 5000/min离心×3eCs; 4、取沉淀,加0.8m无水乙醇悬浮沉淀,颠倒混匀 装入离心纯化柱,12000/min离心×1min,弃乙醇 液; 5、空柱再12000r/min离心×1min,进一步弃乙醇液; 6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5m离心管中,加 入100uT缓冲液于纯化树脂上(不能粘在管壁上), 室温下放置3min,12000r/mn离心×2min

操作 1、将全血轻轻混匀，转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中， 颠倒混匀5-6次，室温，3min。其间要颠倒混匀1次， 5000r/min离心×3sec； 2、取沉淀，加1mlGN结合液悬浮沉淀，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec； 3、取沉淀，加0.5ml漂洗液纯化树脂2次，颠倒混匀， 5000r/min离心×3ecs； 4、取沉淀， 加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀，颠倒混匀； 装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙醇 液； 5、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液； 6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加 入100ul TE缓冲液于纯化树脂上（不能粘在管壁上）， 室温下放置3min，12000r/min离心×2min

注意事项 般情况下,纯净的 DNA OD260/○D280比值 约为1.8,RNA为20。若样品中含蛋白质,则比 值下降,必要时需重新抽提。若DNA的比值 <175,则加入SDS至0.5%; 从核酸中去除蛋白质时,常用到酚:氯仿等体 积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助 于水相和有机相的分离; DNA用TE溶解,可增加DNA的稳定性,便于长 期保存

注意事项 • 一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值 约为1.8，RNA为2.0。若样品中含蛋白质，则比 值下降，必要时需重新抽提。若DNA的比值 <1.75，则加入SDS至0.5%； • 从核酸中去除蛋白质时，常用到酚：氯仿等体 积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助 于水相和有机相的分离； • DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长 期保存

二、PCR扩增技术

二、PCR扩增技术

实验原理 多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。可简述为: 在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微 量模板DNA,四种脱氧核苷酸(dNTP), 和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物, 并有Mg2+存在

实验原理 • 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。可简述为： • 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微 量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP）， 和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物， 并有Mg2+存在