复旦大学：《细胞与医学遗传学——基因诊断基因治疗》电子讲义_第二部分 基因治疗 第二章 基因治疗的发展历程

第二章基因治疗 的发展历程 基因治疗的发展历程 基因治疗的早期科学依据是基因 能够被转移。在1972年DNA重组时代 到来之前的1966年, Edward Tatun曾 就病毒介导基因转移这一现象预言“病 毒将有效地应用于对人类有益的事情 上,如运用分离、设计、合成和引入新 基因对特定器官有缺陷细胞的治疗 法”。也可“通过修改和调节基因活动 或通过基因修复或替代可达到治疗癌 的目的”。之后,通过基因转移来实现 疾病治疗就作为一个科学热点问题不 断被探讨。 有学者将基因治疗的发展划分为 3个历史阶段,即 1准备期(1980~1989年)20 世纪80年代初,从学术界到宗教、伦 理、法律各界,对基因治疗能否进入临 床存在争议很大。直到1989年,FDA 才同意先将载体导入作为“基因标记 的临床试验,1990年正式批准进入临 床试验。在这个阶段中,科学家们进行 了大量的研究工作,同时也在舆论上做 了很多准备工作。 2狂热期(1990~1995年)1990 年9月,美国国立卫生研究院的 Anderson和Base将腺苷酸脱氨酶 ADA基因用反转录病毒导入人自身T 淋巴细胞,经扩增后输回患者体内,成 功治愈一位由于ADA基因缺陷导致严 重免疫异常的4岁女孩。自此,全世界 掀起了基因治疗研究的热潮。基因治疗 的内容也由单基因遗传病扩大到多基 因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系

第二章 基因治疗 的发展历程 基因治疗的发展历程 基因治疗的早期科学依据是基因 能够被转移。在 1972 年 DNA 重组时代 到来之前的 1966 年，Edward Tatum 曾 就病毒介导基因转移这一现象预言“病 毒将有效地应用于对人类有益的事情 上，如运用分离、设计、合成和引入新 基因对特定器官有缺陷细胞的治疗 法”。也可“通过修改和调节基因活动 或通过基因修复或替代可达到治疗癌 的目的”。之后，通过基因转移来实现 疾病治疗就作为一个科学热点问题不 断被探讨。 有学者将基因治疗的发展划分为 3 个历史阶段，即： 1 准备期（1980～1989 年） 20 世纪 80 年代初， 从学术界到宗教、伦 理、法律各界，对基因治疗能否进入临 床存在争议很大。直到 1989 年，FDA 才同意先将载体导入作为“基因标记” 的临床试验， 1990 年正式批准进入临 床试验。在这个阶段中，科学家们进行 了大量的研究工作，同时也在舆论上做 了很多准备工作。 2 狂热期（1990～1995 年） 1990 年 9 月，美国国立卫生研究院的 Anderson 和 Base 将腺苷酸脱氨酶 ADA 基因用反转录病毒导入人自身 T 淋巴细胞，经扩增后输回患者体内，成 功治愈一位由于 ADA 基因缺陷导致严 重免疫异常的 4 岁女孩。自此，全世界 掀起了基因治疗研究的热潮。基因治疗 的内容也由单基因遗传病扩大到多基 因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系

统疾病、自身免疫疾病和内分泌疾病 首例基因治疗应用获得成功带来 医学生物学领域的一片狂热。以美国为 例,短短数年内,就有100多个临床方 案经FDA批准进入临床试验。从专业 刊物到一般媒体,给人的印象是基因治 疗即将成为临床治疗中一种成熟的方 法。这里既有科学家的盲目乐观,又有 企业界和媒体的“推波助澜”。科学家 在前10年所作的储备在这时几乎倾巢 而出,其中一些还没有成熟到可以取得 疗效的方案也过早地进入了临床试验 这种狂热在国内也有体现。 3理性期(1996年至今) 随 着一位18岁的美国青年在美国宾夕 法尼亚大学人类基因治疗中心接受治 疗时不幸死亡,成为被报道的首例死于 基因治疗的患者。基因治疗从狂热转入 理性化的正常轨道,人们开始对基因治 疗的前景进行冷静的思考与反思,基因 治疗的研究与发展也遇到了前所未有 的压力与挑战。在这种情况下,基因治 疗研究没有冷却。据统计,从1996 1999年,全球的基因治疗临床方案增加 了1倍,治疗病人数也增加了1倍。从 投资来看,除政府投资外,企业界的热 情有增无减,仅1996年企业界的投资 为1990~1995年5年的总和。目前每 年的总投资仍在数十亿美元左右。据不 完全统计,迄今全世界已有超过计划 400个的方案进入临床试验,病例数超 过3000例。专家预测,在本世纪前 年,将会有一部分临床试验方案取得疗 效,第一批基因治疗的产品可能上市。 1哺乳动物细胞的体外遗传修饰 (图)

统疾病、自身免疫疾病和内分泌疾病 等。首例基因治疗应用获得成功带来了 医学生物学领域的一片狂热。以美国为 例，短短数年内，就有 100 多个临床方 案经 FDA 批准进入临床试验。从专业 刊物到一般媒体，给人的印象是基因治 疗即将成为临床治疗中一种成熟的方 法。这里既有科学家的盲目乐观，又有 企业界和媒体的“推波助澜”。科学家 在前 10 年所作的储备在这时几乎倾巢 而出，其中一些还没有成熟到可以取得 疗效的方案也过早地进入了临床试验。 这种狂热在国内也有体现。 3 理性期（1996 年至今） 随 着一位 18 岁的美国青年在美国宾夕 法尼亚大学人类基因治疗中心接受治 疗时不幸死亡，成为被报道的首例死于 基因治疗的患者。基因治疗从狂热转入 理性化的正常轨道，人们开始对基因治 疗的前景进行冷静的思考与反思，基因 治疗的研究与发展也遇到了前所未有 的压力与挑战。在这种情况下，基因治 疗研究没有冷却。据统计，从 1996～ 1999 年，全球的基因治疗临床方案增加 了 1 倍，治疗病人数也增加了 1 倍。从 投资来看，除政府投资外，企业界的热 情有增无减，仅 1996 年企业界的投资 为 1990～1995 年 5 年的总和。目前每 年的总投资仍在数十亿美元左右。据不 完全统计，迄今全世界已有超过计划 400 个的方案进入临床试验，病例数超 过 3000 例。专家预测，在本世纪前 10 年，将会有一部分临床试验方案取得疗 效，第一批基因治疗的产品可能上市。 1 哺乳动物细胞的体外遗传修饰 （图）

对哺乳动物细胞体外修饰主要有有3种 途径,即显微注射法、反转录病毒法和 胚胎干细胞法。 受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研 宄移核实验的基础上发展而来。已经成 功地建立了转基因小鼠、转基因绵羊 转基因猪等等,可见显微注射法是迄今 应用得较为普遍而又最有成效的一种 获得转基因动物的技术 右图为镜下所见显微注射过程 胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞 (embryonic stem cell ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细 胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细 胞,这种细胞具有发育的多能性,能够 分化出各种组织。这个途径是将外源基 因直接导人ES细胞,经体外培养筛选 后再注入到受体囊胚腔中,与其中的囊 胚细胞聚集在一起,成为受体胚胎的 部分,参与其分化。由这种胚胎发育而 成嵌合体的转基因动物,即其中有一部 分组织来源于整合有外源基因的供体 ES细胞。在嵌合过程中,被转化的ES 细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交 将引人的外源基因传递下去 反转录病毒转移基因 反转录病毒是一类含有RNA的动 物病毒,它的基因组进入寄主细胞内

对哺乳动物细胞体外修饰主要有有 3 种 途径，即显微注射法、反转录病毒法和 胚胎干细胞法。 受精卵原核显微注射法 显微注射技术是从动物胚胎学研 究移核实验的基础上发展而来。已经成 功地建立了转基因小鼠、转基因绵羊、 转基因猪等等，可见显微注射法是迄今 应用得较为普遍而又最有成效的一种 获得转基因动物的技术。 右图为镜下所见显微注射过程 胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞(embryonic stem cell， ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细 胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细 胞，这种细胞具有发育的多能性，能够 分化出各种组织。这个途径是将外源基 因直接导人 ES 细胞，经体外培养筛选 后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊 胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一 部分，参与其分化。由这种胚胎发育而 成嵌合体的转基因动物，即其中有一部 分组织来源于整合有外源基因的供体 ES 细胞。在嵌合过程中，被转化的 ES 细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交 将引人的外源基因传递下去。 反转录病毒转移基因 反转录病毒是一类含有 RNA 的动 物病毒，它的基因组进入寄主细胞内

在反转录酶催化下合成DNA。反转录 病毒的这种特性说明它有可能是一种 天然的转导因子,可经人工操作改建为 动物基因的转移载体。另外,反转录病 毒感染效率高,但却不会招致寄主细胞 的死亡,被它感染或转化的动物细胞常 可持续许多世代。反转录病毒可用作载 体的另一个优点是其寄主范围广泛,包 括无脊椎动物和脊椎动物,其中有的还 能够在人体细胞中生长 2动物的直接基因转移 将基因直接转移至动物的局部器 官内,使部分的组织细胞带有目的基 3病毒载体的起源 fiber hexon penton stranded DNA single-stranded DNA 毒载体是指以病毒为基础的基因载体。具体过程是 对病毒基因组进行操作和改造,使它携

在反转录酶催化下合成 DNA。反转录 病毒的这种特性说明它有可能是一种 天然的转导因子，可经人工操作改建为 动物基因的转移载体。另外，反转录病 毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞 的死亡，被它感染或转化的动物细胞常 可持续许多世代。反转录病毒可用作载 体的另一个优点是其寄主范围广泛，包 括无脊椎动物和脊椎动物，其中有的还 能够在人体细胞中生长。 2 动物的直接基因转移 将基因直接转移至动物的局部器 官内，使部分的组织细胞带有目的基 因。 3 病毒载体的起源 病 毒 载 体 是 指 以 病 毒 为 基 础 的 基 因 载 体 。 具 体 过 程 是 对病毒基因组进行操作和改造，使它携

带外源基因和相关基因元件,并被包装 成病毒颗粒。携带外源基因的病毒载体 被包装成病毒颗粒就构成了基因导入 系统( gene delivery system) 大多数野生型病毒对机体具有致 病性。因此需要对其进行改造后才能用 于人体。原则上,各种类型的病毒都能 被改造成病毒载体。近20年来,只有 少数几种病毒如反转录病毒(包括HV 病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱 疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒 及EB病毒)被成功地改造成为基因转 移载体并开展了不同程度的应用。随 着分子病毒学和生物技术手段的发展, 将反向遗传学方法应用到病毒载体构 建,使许多RNA病毒如 Sindbis病毒 流感病毒、仙台病毒等被成功地改造成 病毒载体。 用于基因治疗和疫苗的病毒载体 应具备以下基本条件: (1)携带外源基因并能包装成病 毒颗粒 (2)介导外源基因的转移和表达; (3)对人体不致病 (4)在环境中不会引起增殖和传 播。 目前在基因治疗研究或临床试验 上,多使用病毒载体。但病毒载体亟待 解决的是其安全性问题。有不少逆转录 病毒作为基因载体引起疾病、副反应的 案例。因此,逆转录病毒载体逐渐被淘 汰,而多用腺病毒和腺相关病毒,腺病 毒载体用于肿瘤基因治疗的优点是:易 于培养和纯化;基因组大,因而可插入 大片段外源基因;可高效地转导不同类 型的人组织细胞;可转导非分裂细胞 在细胞培养物中有高滴度的重组病毒 产量;进入细胞内并不整合到宿主细胞 基因组,仅瞬间表达,因而安全性较高 可原位感染组织,如肺等。缺点有:表

带外源基因和相关基因元件，并被包装 成病毒颗粒。携带外源基因的病毒载体 被包装成病毒颗粒就构成了基因导入 系统 （gene delivery system） 。 大多数野生型病毒对机体具有致 病性。因此需要对其进行改造后才能用 于人体。原则上，各种类型的病毒都能 被改造成病毒载体。近 20 年来，只有 少数几种病毒如反转录病毒（包括 HIV 病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱 疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒 及 EB 病毒）被成功地改造成为基因转 移载体并开展了不同程度的应用。 随 着分子病毒学和生物技术手段的发展， 将反向遗传学方法应用到病毒载体构 建，使许多 RNA 病毒如 Sindbis 病毒、 流感病毒、仙台病毒等被成功地改造成 病毒载体。 用于基因治疗和疫苗的病毒载体 应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病 毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传 播。 目前在基因治疗研究或临床试验 上，多使用病毒载体。但病毒载体亟待 解决的是其安全性问题。有不少逆转录 病毒作为基因载体引起疾病、副反应的 案例。因此，逆转录病毒载体逐渐被淘 汰，而多用腺病毒和腺相关病毒，腺病 毒载体用于肿瘤基因治疗的优点是：易 于培养和纯化；基因组大，因而可插入 大片段外源基因；可高效地转导不同类 型的人组织细胞；可转导非分裂细胞； 在细胞培养物中有高滴度的重组病毒 产量；进入细胞内并不整合到宿主细胞 基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高； 可原位感染组织，如肺等。缺点有：表

达外源基因时间短,免疫原性强,可引 发机体产生强烈的炎症反应和免疫反 应;几乎可以感染所有细胞,缺乏特异 性。毒性较大,免疫反应重。较为优胜 的是腺相关病毒,腺相关病毒(AAV) 具有病毒基因组很小,如2型腺相关病 毒是由4681个核苷酸组成的单链 DNA,AAV可感染分裂期及静止期细 胞,当辅助病毒不存在时,AAV能整 合到宿主细胞基因组的特定区域,无致 i性,免疫原性弱,因此,它无毒高效, 是目前理想的基因治疗载体 内切核酸酶I 3 末端转移酶 ATP或dTP 4重组DNA技术的诞生重组 DM聚合酶 RI (0.145) A Ngn ot mbinant dna)技术发展于70年代,是 基因工程的核心内容 1972年,P.Berg等在PNAS上发 表了题为:“将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA的生物化学方法:含有λ噬 菌体基因和 E coli半乳糖操纵子的环

达外源基因时间短，免疫原性强，可引 发机体产生强烈的炎症反应和免疫反 应；几乎可以感染所有细胞，缺乏特异 性。毒性较大，免疫反应重。较为优胜 的是腺相关病毒，腺相关病毒（AAV） 具有病毒基因组很小，如 2 型腺相关病 毒是由 4681 个核苷酸组成的单链 DNA，AAV 可感染分裂期及静止期细 胞，当辅助病毒不存在时，AAV 能整 合到宿主细胞基因组的特定区域，无致 病性，免疫原性弱，因此，它无毒高效， 是目前理想的基因治疗载体。 4 重 组 D N A 技 术 的 诞 生 重 组 D N A ( r e c o mbinant DNA)技术发展于 70 年代，是 基因工程的核心内容。 1972 年，P.. Berg 等在 PNAS 上发 表了题为：“将新的遗传信息插入 SV40 病毒 DNA 的生物化学方法：含有 λ 噬 菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子的环

状SV40DNA”,标志着基因工程技术 的诞生。sV40病毒是猿猴病毒,其DN 上有一个限制性内切酶 E coR I的切 点,Berg等用化学方法构建了一个二聚 体的环状SV40DNA。 右图:图A示Berg构建重组s40 二聚体的方法。图B为SV40病毒基因 组 然 B Donor DNA fragments Add DNA ligase Transformed cell 的工作具有划时代的意义,但是他们并没 有证明体外重组的DNA分子具有生物 学功能。至1973年, S.N. Cohen等构建

状 SV40DNA”，标志着基因工程技术 的诞生。SV40 病毒是猿猴病毒，其 DNA 上有一个限制性内切酶 E.coRⅠ的切 点，Berg 等用化学方法构建了一个二聚 体的环状 SV40DNA。 右图：图 A 示 Berg 构建重组 SV40 二聚体的方法。图 B 为 SV40 病毒基因 组。 虽 然 B e r g 的 工 作 具 有 划 时 代 的 意 义 ， 但 是 他 们 并 没 有证明体外重组的 DNA 分子具有生物 学功能。至 1973 年，S.N.Cohen 等构建

了第一个有功能的重组体。宣布体外构 建的细菌质粒能够在细胞中进行表达 他们用pSC101作为重组DNA的 载体分子。将R6-5DNA连接上去,抗 性筛查后进行了酶切检测。结果说明不 同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在 细胞内进行重组连接形成有功能的重 组质粒。这一结果也提示,如果能够在 体外重组成功,并能将重组体引入细胞 内,同样具有生物学功能 5早期基因治疗的应用 人类首例合法地进行基因治疗,始 于1990年月美国NIH批准基因治疗的 临床试验。截至1998年5月15日,全 球共有329项基因治疗计划,其中包括 些基因标记临床计划,有303项进入 Ⅰ期临床试验,有2557例患者接受了基 因治疗,大部分从1995年12月开始执 行。由于试验的时间不够或效果不明 显,少有进入Ⅱ期临床试验。另一批从 1992年开始的肿瘤基因治疗计划,主要 是ADA-SCID和HSV-tk基因计划,由 于有较明确的临床效果,受试人数不断 扩大,部分已进入Ⅲ期临床试验

了第一个有功能的重组体。宣布体外构 建的细菌质粒能够在细胞中进行表达。 他们用 pSC101 作为重组 DNA 的 载体分子。将 R6-5DNA 连接上去，抗 性筛查后进行了酶切检测。结果说明不 同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在 细胞内进行重组连接形成有功能的重 组质粒。这一结果也提示，如果能够在 体外重组成功，并能将重组体引入细胞 内，同样具有生物学功能。 5 早期基因治疗的应用 人类首例合法地进行基因治疗，始 于 1990 年月美国 NIH 批准基因治疗的 临床试验。截至 1998 年 5 月 15 日，全 球共有 329 项基因治疗计划，其中包括 一些基因标记临床计划，有 303 项进入 I 期临床试验，有 2557 例患者接受了基 因治疗，大部分从 1995 年 12 月开始执 行。由于试验的时间不够或效果不明 显，少有进入 II 期临床试验。另一批从 1992 年开始的肿瘤基因治疗计划，主要 是 ADA-SCID 和 HSV-tk 基因计划，由 于有较明确的临床效果，受试人数不断 扩大，部分已进入 III 期临床试验

科学家们对基因治疗进行了积极 的探索,但也发现了一些严重的问题。 如1999年,美国宾州大学一名18岁的 男孩在接受基因治疗其先天 ammonia 代谢不全症( Ornithine Transcarbamylase Deficiency,OIC)时死亡,来年2月,美 国FDA停止该中心所有的基因治疗临 床试验。无独有偶,2002年9月,法国 亦发生第一个接受基因治疗的男孩产 生白血病的案例,该案例是x- linked多 重免疫性的疾病,病人为俗称的 bubble boys。到了2003年又发生了第二例白 血病案例。双重的挫败,严重打击基因 治疗研发领域,不过探究其原因,是使 用的病毒载体造成免疫与毒性等潜在 问题,因此如何研发一套非病毒基因传 送系统,就成了基因治疗成功与否的关 键因素 右图 Bubble-boy(性联重症联合免疫缺 陷)

科学家们对基因治疗进行了积极 的探索，但也发现了一些严重的问题。 如 1999 年，美国宾州大学一名 18 岁的 男孩在接受基因治疗其先天 ammonia 代谢不全症(Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTC)时死亡，来年 2 月，美 国 FDA 停止该中心所有的基因治疗临 床试验。无独有偶，2002 年 9 月，法国 亦发生第一个接受基因治疗的男孩产 生白血病的案例，该案例是 x-linked 多 重免疫性的疾病，病人为俗称的 bubble boys。到了 2003 年又发生了第二例白 血病案例。双重的挫败，严重打击基因 治疗研发领域，不过探究其原因，是使 用的病毒载体造成免疫与毒性等潜在 问题，因此如何研发一套非病毒基因传 送系统，就成了基因治疗成功与否的关 键因素。 右图 Bubble-boy（性联重症联合免疫缺 陷）

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