复旦大学：《细胞与医学遗传学——基因诊断基因治疗》电子讲义_第一部分 基因诊断 第六章 基因诊断的临床应用

第六章基因 诊断的临床应 用 1遗传病的基因诊断 本章详述基因诊断在临 床上的应用,分为1.遗传病基因 诊断、2双生子卵性分析、3.法 医学分析、4疾病易感性分析、 5病原微生物的检测五个章节 以遗传病的基因诊断为主,又分 为内外科疾病、儿科疾病、眼科 疾病、染色体疾病等几部分,以 下分别详述 内外科疾病 本节分类详述各疾病的检测方 法,分为血液系统疾病、神经肌 肉系统疾病、泌尿系统疾病、心 血管系统疾病、呼吸系统疾病几 大类 内外科疾病:血液 系统疾病 1.1.1.1血友病A 一般特点:经典的X连锁隐性遗 传病。英国女王维多利亚 (1819-1901)作为携带者把该 基因传致欧洲多个王室 临床特征:凝血障碍性疾病:出 血时间延长、淤血、关节肌肉和 颅腔出血 发病率:男性1/10000

第六章 基因 诊断的临床应 用 1 遗传病的基因诊断 本章详述基因诊断在临 床上的应用，分为 1.遗传病基因 诊断、2.双生子卵性分析、3.法 医学分析、4.疾病易感性分析、 5.病原微生物的检测五个章节， 以遗传病的基因诊断为主，又分 为内外科疾病、儿科疾病、眼科 疾病、染色体疾病等几部分，以 下分别详述。 1.1 内外科疾病 本节分类详述各疾病的检测方 法，分为血液系统疾病、神经肌 肉系统疾病、泌尿系统疾病、心 血管系统疾病、呼吸系统疾病几 大类。 1.1.1 内外科疾病：血液 系统疾病 1.1.1.1 血友病 A 一般特点：经典的 X 连锁隐性遗 传病。英国女王维多利亚 （1819-1901）作为携带者把该 基因传致欧洲多个王室 临床特征：凝血障碍性疾病：出 血时间延长、淤血、关节肌肉和 颅腔出血 发病率：男性 1/10000

遗传学:X连锁隐性遗传,基因 定位Xq28,基因全长186kb,26 外显子,25内含子,编码2332 个氨基酸 基本缺陷:编码凝血因子(Ⅷ因 子)基因多种不同的突变 病理生理学:Ⅷ因子缺陷致 fibrin形成缺陷,不能凝血 治疗:补充Ⅷ因子,或从血中提 取,或通过基因工程方法获得 诊断方式: LPs 14 Noma…4-A southern AAA G AAA GCT TGA CTT CAC Mutant Lys- Ala -Stop 血友病 A 外显子24:C→T 区A→

遗传学：X 连锁隐性遗传，基因 定位 Xq28，基因全长 186kb，26 外显子，25 内含子，编码 2332 个氨基酸 基本缺陷：编码凝血因子（Ⅷ因 子）基因多种不同的突变 病理生理学：Ⅷ因子缺陷致 fibrin 形成缺陷，不能凝血 治疗：补充Ⅷ因子，或从血中提 取，或通过基因工程方法获得 诊断方式： R F L P s + S o u t h e r n 血 友 病 A 外显子 24: C→T Taq I TCGA→TTGA

N:1.4kb;M:4.2kb 如图所示,检测出单个碱基 替换改变了血友病A家族中 因子Ⅷ基因外显子24的TaqI 限定酶识别位点。A因子Ⅷ基因 探针在X染色体上检测出一段 4- kb Taq I片段,但在突变体则 检测到42-kb片段。在这个家 族中,女孩不会是突变体的携带 s clI探针B 14.5Ss1/探针A 缺失Ⅷ因子基因 mI■ m■ 正常Ⅷ因子基因 血 友 病A 多态性 Bgl i

AGCT→AACT N：1.4kb；M：4.2kb 如图所示，检测出单个碱基 替换改变了血友病 A 家族中， 因子Ⅷ基因外显子 24 的 Taq I 限定酶识别位点。A 因子Ⅷ基因 探针在 X 染色体上检测出一段 1.4-kbTaq I 片段，但在突变体则 检测到 4.2-kb 片段。在这个家 族中，女孩不会是突变体的携带 者。 R F L P s + S o u t h e r n 血 友 病 A 多态性 Bgl I

N:20kb:M:5kb连锁 右图:RFLP对Ⅷ因子基因部分 缺失所致血友病A的基因诊断。 探针A是Ⅷ因子基因1.7kbpn I CDNA片段,包括1~12外显 子。探针B是Ⅷ因子基因4.7kb ECOR I CDNA片段,包括14~25 和部分26外显子。A、B、C、D 代表染色体。患者无Bcl/探针B 1.2kb和探针A4.4kb片段,但 有SstI/探针A14.5kb片段。 友 I:.Ⅲ,Ⅱ;Ⅲ 病 引物(探针):

N：20kb；M：5kb 连锁 右图：RFLP 对Ⅷ因子基因部分 缺失所致血友病 A 的基因诊断。 探针 A 是Ⅷ因子基因 1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括 1～12 外显 子。探针 B 是Ⅷ因子基因 4.7kb EcoR I cDNA 片段，包括 14～25 和部分 26 外显子。A、B、C、D 代表染色体。患者无 Bcl/探针 B 1.2kb 和探针 A 4.4kb 片段，但 有 Sst I/探针 A14.5kb 片段。 P C R + A S O 血 友 病 A P C R + ASO Xba I 引物（探针）：

XbaI(+)7.3 baSo探针 GCGCATTTCTAGACTGTTG XbaI(-)7.3 baSO探针 -GCGCATTTCTGACTGTTG 右图:利用PCR-ASO探针连锁 分析对血友病A做出生前诊断。 白细胞和绒毛细胞DNA由PCR 扩增XbaI识别部位顺序,用 XbaI识别部位(+)的7.3 baSO 探针和 Xha l识别部位(-)的 7.4 baSO探针杂交。正常Ⅷ因 子基因为XbaI(-),突变Ⅷ因 子基因为XbaI(+)。本例中胎 儿为男性,未受累血友病A 1.1.1.2镰状细胞贫血 一般特点:具有杂合子优势的疾 病,第一个成功进行基因诊断、 产前基因诊断的病例 临床特征:红细胞扭曲成镰刀 形,溶血性贫血,镰状细胞痛性 危象 发病率:非洲黑人常见:美洲黑 人:1/400 遗传学:常染色体隐性遗传,基 因定位11p 基本缺陷: CCTGAGG CCTGTGG:

Xba I（+）7.3kbASO 探针 5ˊ -GCGCATTTCTAGACTGTTG -3ˊ Xba I（-）7.3kbASO 探针 5ˊ -GCGCATTTCTGGACTGTTG -3ˊ 右图：利用 PCR-ASO 探针连锁 分析对血友病A做出生前诊断。 白细胞和绒毛细胞DNA由PCR 扩增 Xba I 识别部位顺序，用 Xba I 识别部位（+）的 7.3kbASO 探针 和 Xba I 识别部位（-）的 7.4kbASO 探针杂交。正常Ⅷ因 子基因为 Xba I（-），突变Ⅷ因 子基因为 Xba I（+）。本例中胎 儿为男性，未受累血友病 A。 1.1.1.2 镰状细胞贫血 一般特点：具有杂合子优势的疾 病，第一个成功进行基因诊断、 产前基因诊断的病例 临床特征：红细胞扭曲成镰刀 形，溶血性贫血，镰状细胞痛性 危象 发病率：非洲黑人常见；美洲黑 人：1/400 遗传学：常染色体隐性遗传，基 因定位 11p 基本缺陷：CCTGAGG→ CCTGTGG： βA→βS

病理生理学:HbA(第6位谷氨酸) HbS(第6位缬氨酸),b溶解 度下降,HbS凝聚成管状 治疗:临床常规贫血治疗(输血、 骨髓移植、基因治疗) Hpa|β珠蛋白基因片段(kb) Hb基因型 总计130kb片段的频率 76/7.67.6/707.0/13.0 76/13.013.013.0 白人AS 0.31 0 11 0.87 AA 0

病理生理学：HbA(第 6 位谷氨酸) →HbS(第 6 位缬氨酸)，Hb 溶解 度下降，HbS 凝聚成管状 治疗：临床常规贫血治疗（输血、 骨髓移植、基因治疗） —————————————— —————————————— —————————————— ————————————— Hpa Iβ珠蛋白基因片段（kb） Hb基因型 —————————————— ————————————— 总 计 13.0kb片段的频率 7.6/7.6 7.6/7.0 7.0/13.0 7.6/13.0 13.0/13.0 —————————————— —————————————— —————————————— ————————————— 白人AS 5 1 1 9 0 16 0.31 SS 0 0 0 4 11 15 0.87 AA 12 0 0 0 0 12

黑人AA 8 6 0 0.03 亚洲AA RFLP 13 kb 常 父母儿儿胎 镰状细胞贫 血 第1个基因诊断、产前基因诊断 成功病例

0 黑人 AA 8 6 0 1 0 15 0.03 亚洲 AA 15 0 0 0 0 15 0 —————————————— —————————————— —————————————— ————————————— R F L P + S o u t h e r n 镰 状 细 胞 贫 血 第 1 个基因诊断、产前基因诊断 成功病例

RFLP连锁 家系 右图:RFLP连锁分析进行产前 基因诊断 HpaI切割人类DNA所形 成不同长度的DNA片段,用 RFLP连锁分析法可进行镰状细 胞贫血症的产前诊断,在此例 中,患儿仅出现13 kbDNA片段, 父母均出现13 kbDNA片段,则 表明有纯合的β,为镰状细胞 贫血症患者,如出现76kb 54kb、则为正常个体 RFLP Southern MstI位点: CCT NAG C BS: CCT GTG GAG Pro- Val- Glu MsⅡ片段 镰状细胞贫血RFLP AS AS AA SS 1.3≤Hh 1.15k

Hpa I RFLP 连锁 家系 右图：RFLP 连锁分析进行产前 基因诊断。 Hpa I 切割人类 DNA 所形 成不同长度的 DNA 片段，用 RFLP连锁分析法可进行镰状细 胞贫血症的产前诊断，在此例 中，患儿仅出现 13kbDNA 片段， 父母均出现 13kbDNA 片段，则 表明有纯合的βs，为镰状细胞 贫血症患者，如出现 7.6kb、 5.4kb、则为正常个体。 RFLP + Southern 镰 状 细 胞 贫 血 R F L P + S o u t

he Mst ll 失去酶切位点:CCI囚G CCTO N:1.15kb+0.2kb;M:1.35kb 右图:用Msl酶切,β珠蛋 白基因做探针的HbS基因诊断 正常β珠蛋白基因产生1.15kb 和0.2kb两个片段,而HbS的β 珠蛋白基因失去了这个MSIl 识别顺序,只产生1.35kb的片 段 ASO DNA codon 5 6 CCT GAG GAG CCT GAG 镰状细胞贫血As B,( 0探针 Ⅱ 正常探针○●●● 异常探针 ●●●○

hern Mst II 失去酶切位点：CCTGAGG→ CCTGTGG N：1.15kb + 0.2kb；M：1.35kb 右图：用 Mst II 酶切，β珠蛋 白基因做探针的HbS基因诊断。 正常β珠蛋白基因产生 1.15kb 和 0.2kb 两个片段，而 HbS 的β 珠蛋白基因失去了这个 Mst II 识别顺序，只产生 1.35kb 的片 段。 ASO 镰 状 细 胞 贫 血 A S O 探 针 β

A探针 CTCI囚 GAGGAGTCTG βS探针 -CTCCTGIGGAGGAGTCTGC 右图:上:等位基因特异性寡核 苷酸探针(ASO Allele-specific-oligonucleotide 诊断镰形细胞贫血 下:某家系的ASO探针诊断结 果 1.1.1.3a地中海贫血 一般特点:多见于地中海和华南 地区 临床特征:贫血,轻重不等,严 重者致死,轻微者仅轻度贫血 发病率:有地区差异,在地中海 和华南地区常见,其他地区少见 遗传学:常染色体遗传(显性), 基因定位16q13 基本缺陷:患者表现为1-4个(4 个即全部)a基因的缺失

A 探针 5ˊ -CTCCTGAGGAGGAGTCTG C -3ˊ βS探针 5ˊ -CTCCTGTGGAGGAGTCTGC -3ˊ 右图：上：等位基因特异性寡核 苷酸探针（ASO Allele-specific-oligonucleotide ） 诊断镰形细胞贫血 下：某家系的 ASO 探针诊断结 果 1.1.1.3 α地中海贫血 一般特点：多见于地中海和华南 地区 临床特征：贫血，轻重不等，严 重者致死，轻微者仅轻度贫血 发病率：有地区差异，在地中海 和华南地区常见，其他地区少见 遗传学：常染色体遗传（显性）， 基因定位 16q13 基本缺陷：患者表现为 1-4 个（4 个即全部）α基因的缺失