内蒙古农业大学：《分子生物学》课程教学资源（自编教材）分子生物学实验技术指导

内蒙古农业大学自编教材 分子生物学实验技术指导 刘惠荣主编 内蒙古农业大学生物工程学院 二OO七年一月

内蒙古农业大学自编教材 分子生物学实验技术指导 刘惠荣 主编 内蒙古农业大学生物工程学院 二○○七年一月

前言 二十一世纪的今天，分子生物学技术已不再神秘，它的理论和技术已经渗入生物学的各 个分支学科及医药农林的各个分支领域，并衍生出了许多新兴的交叉学科，如分子免疫学、 分子微生物学、分子遗传学、分子药理学等，对分子生物学实验技术的掌握已经成为这些学 科在新的高度和深度揭示生命奥秘的共同需求。 实验教学是高校教学工作中一个重要的组成部分，是培养学生实践能力和创新能力的重 要环节，也是提高学生专业素养和就业竞争力的重要途径。本书是在我们多年用作内蒙古农 业大学生物工程学院生物科学专业本科生实验指导讲义的基础上，经修订和改编而成的，可 以作为我校生物和农林等专业的分子生物学实验指导用书。 本书以基本的分子生物学实验为主，内容包括植物基因组DN人提取及其定性定量分析、 PC℉扩增目的片段和胶回收、目的片段和载体的连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质 粒的转化、质粒DNA的提取及酶切鉴定等六个大实验，每个实验都介绍了实验的基本原理、 实验所需仪器试剂、实验操作步骤、注意事项等，为了大家能更好地掌握和理解实验原理及 关键操作，在每个实验后面罗列了与本实验相关的复习题。本书的编写宗台是简明、实用， 是一本适合任何具有分子生物学基本知识的学校本科生、研究生或单位工作人员使用的教 材。 本书是我们内蒙古农业大学生物工程学院几位老师从教学和科研中不断总结经验而完 成的，几位老师为本书的编写投入了大量精力，在此表示感谢。 由于编写本教材的时间仓促，编者水平有限，书中难免出现疏漏之处，希望读者在使用 的过程中，对书中的不当之处提出批评指正，不胜感激。 编者 2007年1月

前 言 二十一世纪的今天，分子生物学技术已不再神秘，它的理论和技术已经渗入生物学的各 个分支学科及医药农林的各个分支领域，并衍生出了许多新兴的交叉学科，如分子免疫学、 分子微生物学、分子遗传学、分子药理学等，对分子生物学实验技术的掌握已经成为这些学 科在新的高度和深度揭示生命奥秘的共同需求。 实验教学是高校教学工作中一个重要的组成部分，是培养学生实践能力和创新能力的重 要环节，也是提高学生专业素养和就业竞争力的重要途径。本书是在我们多年用作内蒙古农 业大学生物工程学院生物科学专业本科生实验指导讲义的基础上，经修订和改编而成的，可 以作为我校生物和农林等专业的分子生物学实验指导用书。 本书以基本的分子生物学实验为主，内容包括植物基因组 DNA 提取及其定性定量分析、 PCR 扩增目的片段和胶回收、目的片段和载体的连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质 粒的转化、质粒 DNA 的提取及酶切鉴定等六个大实验，每个实验都介绍了实验的基本原理、 实验所需仪器试剂、实验操作步骤、注意事项等，为了大家能更好地掌握和理解实验原理及 关键操作，在每个实验后面罗列了与本实验相关的复习题。本书的编写宗旨是简明、实用， 是一本适合任何具有分子生物学基本知识的学校本科生、研究生或单位工作人员使用的教 材。 本书是我们内蒙古农业大学生物工程学院几位老师从教学和科研中不断总结经验而完 成的，几位老师为本书的编写投入了大量精力，在此表示感谢。 由于编写本教材的时间仓促，编者水平有限，书中难免出现疏漏之处，希望读者在使用 的过程中，对书中的不当之处提出批评指正，不胜感激。 编者 2007 年 1 月

目录 实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析.1 实验二PCR扩增目的片段和胶回收 8 实验三目的片段和载体的连接 15 实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测。 实验五重组质粒的转化. 20 实验六重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 33 实验七RNA的提取(TRIzol法) 实验八mRNA的分离与纯化 .36 实验九RT-PCR技术 实验十用mRNA差异显示法分离特异表达的基因片段 .40 实验十一cDNA文库的构建 .46 实验十二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) .51 实验十三Southern印迹杂交法(Southern blot). .56 实验十四RNA分子杂交(Northern blot) 62 实验十五固定化蛋白质的免疫生化鉴定(Western blot) 67 实验十六RFLP技术. 71 实验十七RAPD技术 .74 实验十八细胞分裂中期染色体的荧光原位杂交技术(ISH田. 16 附录一常用缓冲液及其配制 .80 附录二常用抗生素溶液 .85 附录三常用贮存液的配制。 85 附录四常用核酸蛋白换算数据 附录五染料在凝胶中的迁移速度. .94 附录六实验中的一些好习惯 .95

目 录 实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析. 1 实验二 PCR扩增目的片段和胶回收. 8 实验三 目的片段和载体的连接. 15 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测. 18 实验五 重组质粒的转化. 20 实验六 重组质粒DNA的提取及酶切鉴定. 23 实验七 RNA的提取（TRIzol法）. 30 实验八 mRNA的分离与纯化. 36 实验九 RT-PCR技术. 38 实验十 用mRNA差异显示法分离特异表达的基因片段 . 40 实验十一 cDNA文库的构建. 46 实验十二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） . 51 实验十三 Southern印迹杂交法（Southern blot）. 56 实验十四 RNA分子杂交（Northern blot）. 62 实验十五 固定化蛋白质的免疫生化鉴定（Western blot）. 67 实验十六 RFLP技术. 71 实验十七 RAPD技术. 74 实验十八 细胞分裂中期染色体的荧光原位杂交技术(FISH). 76 附录一 常用缓冲液及其配制. 80 附录二 常用抗生素溶液. 85 附录三 常用贮存液的配制. 85 附录四 常用核酸蛋白换算数据. 93 附录五 染料在凝胶中的迁移速度. 94 附录六 实验中的一些好习惯. 95

实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson(I98O)修改而成的简便方 法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下 (大于0.7MNCI),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氨对植物组织进行研磨， 从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋 白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解 质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本 身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分子的迁移 速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁 移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUC19质粒，有3种构型：超螺 旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA),开环质粒DNA, 即环状质粒DNA的I条链断裂，(open circular DNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即环 状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂(linear DNA,简称LDNA).这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次

1 实验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对 DNA 进行定性定量分析。 【实验原理】 通过 CTAB 法提取植物基因组 DNA 是由 Murray 和 Thompson (1980) 修改而成的简便方 法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下 (大于 0.7M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨， 从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋 白，最后经乙醇沉淀得到 DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电解 质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电 荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本 身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，DNA 分子的迁移 速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁 移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺 旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)，开环质粒 DNA， 即环状质粒 DNA 的 1 条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状质粒 DNA，即环 状质粒 DNA 的 2 条链在同一处发生断裂(linear DNA，简称 L DNA）。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次

为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA 核酸分子(DNA或RNA)油于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在26Om波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1OD26o相当于dsDNA50μgmL,ssDNA33μgmL和ssRNA40ugmL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外 线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有 RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000u山 量程各一支)、胶带、100mL或250mL锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板或 parafilm、吸头、l.5mlEP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(TiS)、乙二胺四乙酸(EDTA人CTAB(十六烷基三甲基溴化铵、B巯 基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠NaC)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、 蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1.2xCTAB buffer 配50ml 100mM Tris-Cl pH8.0 5mL1M贮存液 1.4M NaCl 17.5mL4M贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2mL0.5M贮存液 2%CTAB 需CTAB固体粉末1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇100 2.70%乙醇 3.RNaseA(10mg/mL) 2

2 为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在 260nm波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260nm和 280nm的紫外 线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280 比值高于 2.0，则可能有 RNA污染，低于 1.8 则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL 量程各一支)、胶带、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板或 parafilm、吸头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA )、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯 基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA ) 、溴酚蓝、 蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 配 50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 贮存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M 贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M 贮存液 2% CTAB 需 CTAB 固体粉末 1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇 100 μL 2. 70%乙醇 3. RNaseA (10mg/mL)

4.0.5×TBE缓冲液（工作浓度） 45 nM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配5×TBE(贮存液)1000mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20mL(pH8.0) 5.凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 6.溴化乙锭(EB)贮存液10mgmL 7.DNA marker 8.0.1×TE 9.酚/氯仿(1：1，VW) 【实验步躁】 1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2.加入0.6mL2×CTAB提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30min 每10min颠倒混匀一次。 3.取出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。 4.13,000pm室温离心4min(若没离好可重复一次). 5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中。 6.加等体积氯仿混匀，13,000pm离心4min,取上清。 7.加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置60min。 8.4℃，15.000rpm离心20min。 9.弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，风干。 10.加入25L无菌水（含25 g/mL RNase A),溶解DNA

3 4. 0.5×TBE 缓冲液(工作浓度) 45mM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配 5×TBE (贮存液) 1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5. 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙锭 (EB ) 贮存液 10mg/mL 7. DNA marker 8. 0.1×TE 9. 酚/氯仿 (1:1，V/V)。 【实验步骤】 1. 取约 100mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入 0.6 mL 2×CTAB 提取液(用前加入 0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃ 水浴 30 min， 每 10 min 颠倒混匀一次。 3. 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀。 4. 13,000 rpm 室温离心 4 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液转移到另一 1.5mL 离心管中。 6. 加等体积氯仿混匀，13,000rpm 离心 4 min，取上清。 7. 加入 2 倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置 60 min。 8. 4℃，15,000rpm 离心 20 min。 9. 弃上清，70％乙醇洗沉淀 2 次，风干。 10. 加入 25 μL 无菌水(含 25μg/mL RNase A)，溶解 DNA

1L.取1LDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测 ()制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1.3 称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30L0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至 完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由D-半乳糖和L半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在0.2-50kb之间。 (2)胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮音或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙)，形成一个模具。 ②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形 成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45min),垂直轻拔杭子，取下胶带，将凝 胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。 (3)加样 4

4 11. 取 1μL DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 4 2.0 0.1 - 3 称取 0.3g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 30mL0.5×TBE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至 完全溶化，取出摇匀，则为 1％琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由 D-半乳糖和 L-半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在 0.2-50kb 之间。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 ② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③ 将冷却到 60℃ 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形 成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝 胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1mm。 (3) 加样

在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于I×。用1OuL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证DNA沉入加样孔内：使样品带有颜色 便于简化上样过程：其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于300p的线性双链 DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中DNA分子的迁移位置， (④电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动)。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过5Vlcm。 ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 (⑤染色 将电泳后的凝胶浸入含有0.5ugmL溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温30-45min), 清水脱色10mi,紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保 存。 溴化乙锭(Ethidium bromide,EB),是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和DNA形成络合物，并在约30Om波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度： (1)用0.1×TE对待测DNA样品按120或合适的倍数稀释。 (2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready'” 时，进入核酸测定窗口。 (3)调零。先用0.l×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref键，仪 器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 5

5 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1×。用 10μL 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证 DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色 便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于 300bp 的线性双链 DNA 分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中 DNA 分子的迁移位置。 (4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm。 ② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 (5) 染色 将电泳后的凝胶浸入含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温 30-45min）， 清水脱色 10min，紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保 存。 溴化乙锭（Ethidium bromide, EB），是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和 DNA 形成络合物，并在约 300nm 波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使 DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度： (1) 用 0.1×TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。 (2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready” 时，进入核酸测定窗口。 (3) 调零。先用 0.1×TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪 器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品

(4)吸7OL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用5~TuL的石英样品杯。点击“enter'”键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 和280nm处的光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样品的 浓度等。 (⑤)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入 下一个待测样品。 (6)DNA纯度：以A260/A280比值来反映。当A2601A280比值2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA 【实验结果】 在紫外灯(360nm,312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶（图1-1）。DNA存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用)。 图1-1拟南芥基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果 6

(4) 吸 70μL 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用 5～7μL 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260 和 280nm 处的光密度（OD 值）及 A260/A280nm 和 A280/A260nm 的比率以及 DNA 样品的 浓度等。 (5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入 下一个待测样品。 (6) DNA 纯度：以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值2.0，说明样品存在 RNA 污染，可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。 【实验结果】 在紫外灯（360 nm, 312 nm 或 254 nm ）下观察染色后的电泳凝胶（图 1-1）。DNA 存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用）。 图 1-1 拟南芥基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 6

【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提DNA,下午电泳及紫外分光光度法检测DNA。 【注意事项】 1.尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2.研磨过程中确保样品不要融化，直至加CTAB 3.酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4.所用试剂需灭菌。 5.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7.电泳时应注意电源线路，预防触电。 8.溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验 室内使用。 9.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 1O.DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高：凝胶中有气泡。 11.紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除苯 酚、RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比 实际浓度偏高。 12.测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破：持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1.提取DNA之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2.提取DNA的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3.如何检测、评价提取的DNA的质量？ 4.如何确定提取的DNA的浓度？ 1

7 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提 DNA，下午电泳及紫外分光光度法检测 DNA。 【注意事项】 1．尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA 可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2．研磨过程中确保样品不要融化，直至加 CTAB 3．酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4．所用试剂需灭菌。 5．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7．电泳时应注意电源线路，预防触电。 8．溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验 室内使用。 9．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 10．DNA 带形状模糊：DNA 加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 11．紫外分光光度法不能区分 DNA 分子的构型，如质粒 DNA 分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体 DNA 和 RNA 等。由于测定吸收光度 A260 时，难以排除苯 酚、RNA、染色体 DNA、以及 DNA 解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比 实际浓度偏高。 12．测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破；持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1. 提取 DNA 之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2. 提取 DNA 的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3. 如何检测、评价提取的 DNA 的质量？ 4. 如何确定提取的 DNA 的浓度？