重庆医科大学：《分子生物学》课程教学课件（PPT讲稿）第五章 核酸的序列测定

第五章 核酸的序列测定 易发平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

核酸的序列测定 第五章 易发平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内 容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功 能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的 飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部 遗传信息，正是人类基因组计划(human genome project,.HGP)的最主要目标之一

DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内 容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功 能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的 飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部 遗传信息 ，正 是 人 类基 因 组 计划 （ human genome project, HGP)的最主要目标之一

将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排 列顺序。 DNA序列测定方法： 1.Sangerl的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 ÷2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反 应。 ÷3.自动测序法

将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排 列顺序。 DNA 序列测定方法： ❖ 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 ❖ 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反 应。 ❖ 3.自动测序法

DNA测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法(Sanger 法、酶促法)和化学裂解法(Maxam-Gelbert法)。二者 均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序 反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。 4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列

DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者 均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序 反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。 4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列

70年代末 Walter Gilbert发明化学法 Frederick Sanger发明双脱氧终止法 手动测序，同位素标记 80年代中期 出现自动测序仪 荧光代替同位素，计算机图象识别 90年代中期 测序仪重大改进 集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳

Sanger双脱氧链终止法 (一)原理单链) DNA链中的核苷酸是以3,5磷酸二酯键相连接，合成 DNA所用的底物是2-脱氧核苷三磷酸(dNTP),在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2'，3-双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时，由于它没有3-OH

一、 Sanger 双脱氧链终止法 （一）原理(单链) DNA链中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯键相连接，合成 DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了 2`，3`-双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时,由于它没有3`-OH

不能再与其它的脱氧核苷酸形成3'，5'-磷酸二酯键，DNA 合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP,则 新生链的末端就是A,依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、ddGTP,则新生链的末端为T、C或G,根据 这个原理，Sanger.与1977年建立了双脱氧链终止测序法。 他本人也因此而获得了诺贝尔奖

不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′ ,5′-磷酸二酯键，DNA 合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则 新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G，根据 这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。 他本人也因此而获得了诺贝尔奖

Sanger

Sanger

0 O-P- O-P- 0-CH2 碱基 双脱氧核苷三磷酸 H H H ddNTP ® dATP dGTP 5 OH 互补链合成过程 DDDDOH OH 引物链 T G G 3 A G G T 模板链

双脱氧核苷三磷酸 互补链合成过程

以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生 DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。 主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根 据碱基配对的原则逐个将dTP加到与模板结合的寡核苷 酸引物的3'-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；②能 以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡 核苷酸链的3'末端而终止新生互补链的延伸

以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生 DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。 主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根 据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷 酸引物的3′-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；②能 以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡 核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸