安徽大学：《基因工程》课程授课教案（讲义，共八章）

《基因工程原理》教案 (二0一二年修订稿) 安徽大学生命科学学院 1

1 《基因工程原理》教案 （二 O 一二年修订稿） 安徽大学生命科学学院

第一章绪论 重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。 难点：基因工程与遗传工程的区别。 (一)前言 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。 (二)什么是基铟、基因工程 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能 力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含 有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝或其 表达产物。 (三)基因工程的主要内容 ■目的基因的制备 ■载体的选择和制备 ■DNA分子的体外连接 ■将外源DNA导入宿主细胞 ■目的基因的筛选和鉴定 (四)基因工程的历史及我国开展基因工程的现状 第二章基因工程的基本操作技术 重点：PCR技术和基因定点诱变技术。包，括PCR技术的原理，反向PCR与染色体 步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD,RT-PCR与RNA分析；基 因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PC诱变。 2

2 第一章 绪论 重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。 难点：基因工程与遗传工程的区别。 （一）前言 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等 4 个部分。 （二）什么是基因、基因工程 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA 结合成一具有自我复制能 力的 DNA 分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含 有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子拷贝或其 表达产物。 （三）基因工程的主要内容 ◼ 目的基因的制备 ◼ 载体的选择和制备 ◼ DNA 分子的体外连接 ◼ 将外源 DNA 导入宿主细胞 ◼ 目的基因的筛选和鉴定 （四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状 第二章 基因工程的基本操作技术 重点：PCR 技术和基因定点诱变技术。包括 PCR 技术的原理，反向 PCR 与染色体 步移，不对称 PCR 与 DNA 序列测定，PCR 与 RAPD，RT-PCR 与 RNA 分析；基 因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和 PCR 诱变

难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序 (一)凝胶电泳技术 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际 上呈多聚阴离子状态(Polyanions,将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 一正极移动。 >琼脂糖凝胶电泳 >聚丙烯酰胺凝胶电泳 >脉冲场凝胶电泳 RNA电泳 (二)细菌转化技术 ·转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一 种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现 象。 ·提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做 受体菌株。 常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法 （三)核酸杂交技术 ·所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它 们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 ·Southern blot;Northern blotting;斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原 位杂交 注意比较 3

3 难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。 （一）凝胶电泳技术 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以 DNA 和 RNA 实际 上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将 DNA、RNA 放到电场中，它就会由负极 →正极移动。 ➢ 琼脂糖凝胶电泳 ➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ➢ 脉冲场凝胶电泳 ➢ RNA 电泳 （二）细菌转化技术 ▪ 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一 种基因型细胞的 DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现 象。 ▪ 提供转化 DNA 的菌株叫做供体菌株，而接受转化 DNA 的寄主菌株则称做 受体菌株。 常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法； 电穿孔法 （三）核酸杂交技术 ▪ 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA，当它 们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 ▪ Southern blot；Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原 位杂交 注意比较

核酸分子杂交法的技术路线比较 菌落原位杂交 赛点杂交Southern印迹Northern印述 菌落或赠菌斑转印拉提DNA/RNA提取DN 提取RN “到陕上 裂解细菌或噬离疼变性核玻样品 球脂糖颜胶电泳 变性DN将楼酸点加到膜上 生胎装 将枝酸固定在膜上一预染交（消除非特异吸附位点）一加入 核素标记探针进行杂交 异结合探针)一 放射自显彩减显色反应示踪 (四)DNA测序分析 ·DNA链末端合成终止法：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准 确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合 到新生寡核苷酸链的3'末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加 入模板DNA,引物（特异性引物，如T7,T3,M13等），DNA聚合酶，dA,dT, dG,dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性. ·Maxam-Gilbert化学修饰法（哈佛大学）：该方法的基本原理是用化学试剂 处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具 有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放谢自显影之后，可直接 读出待测DNA片段的核苷酸序列。 DNA杂交测序法SBH-Sequencing by hybridization):如果一段较短的DNA 探针能与较长的DNA片段杂交并形成完全的双链结构我们就推测在靶DNA 上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知 4

4 （四）DNA 序列分析技术 （四）DNA 测序分析 ▪ DNA 链末端合成终止法：DNA 聚合酶能够用单链 DNA 作为模板，合成准 确的 DNA 互补链；② 该酶能够用 2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合 到新生寡核苷酸链的 3'-末端，从而终止其延伸反应。在 DNA 测序反应中，加 入模板 DNA，引物（特异性引物，如 T7，T3，M13 等），DNA 聚合酶，dA，dT， dG，dC 和一种 ddNTP。常用 Klenow 大片段，无 5'→3'外切酶活性。 ▪Maxam-Gilbert 化学修饰法(哈佛大学)：该方法的基本原理是用化学试剂 处理具有末端放射性标记的 DNA 片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具 有不同长度的 DNA 链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接 读出待测 DNA 片段的核苷酸序列。 ▪DNA 杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)：如果一段较短的 DNA 探针能与较长的 DNA 片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶 DNA 上存在着相应的互补序列，这就是 DNA 杂交测序法的基本原理。用一组已知 核酸分子杂交法的技术路线比较 菌落原位杂交 菌落或噬菌斑转印 到膜上 抽提DNA/RNA 提取DNA 提取RNA 裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳 变性DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移到膜 上，同时变性 将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入 核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针）→ 放射自显影或显色反应示踪 斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹

系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定 其序列。 (五)基因的化学合成 (六)PCR技术 ·PCR反应体系的设立 ·PCR反应程序设计 ·引物设计原理 ·PCR技术应用 (七)基因定点诱变技术 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变 化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段 ·盒式诱变(cassette mutagenesis)包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两 种方式 ·寡核苷酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做3引物 进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分 ·PCR诱变：重组PCR定点诱变、大引物诱变 (八)DNA与蛋白质相互作用 ·凝胶阳滞实验elretardation assay)又称DNA迁移率变化试验DNA mobility shift assay, DMSA):DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质 发生结合 ·DNasel印迹试验(DNasel foot printing)用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特 5

5 系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶 DNA 分子杂交，从而测定 其序列。 （五）基因的化学合成 （六）PCR 技术 ▪ PCR 反应体系的设立 ▪ PCR 反应程序设计 ▪ 引物设计原理 ▪ PCR 技术应用 （七）基因定点诱变技术 使已克隆基因或 DNA 片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变 化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 ▪ 盒式诱变（cassette mutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两 种方式。 ▪ 寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物， 进行 DNA 复制，使寡核苷酸引物成为新合成的 DNA 子链的一个部分 ▪ PCR 诱变：重组 PCR 定点诱变、大引物诱变 （八）DNA 与蛋白质相互作用 ▪ 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），又称DNA迁移率变化试验（DNA mobility shift assay， DMSA）：DNA 与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断 DNA 是否与蛋白质 发生结合 ▪ DNaseI 印迹试验（DNaseI foot printing） 用于检测与蛋白结合的 DNA 序列的部位及特

性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域， ·甲基化干扰实验：根据DM5(硫酸二甲酯)能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够 特异切割甲基化的G残基这一原理，这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基 化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNM与蛋白质之间 相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足 迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 第三章基因工程的工具酶 重点：限制性内切酶、DNA连接和DNA聚合酶的生化待征、作用原理和应用领域。包括 Ⅱ型限制性内切酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow 酶，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，反转录酶，Taq DNA聚合酶，PfuDNA聚合酶和反转 录酶。T4多核甘酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。 难点：切口转移与核苷酸标记技术 (一)限制性内切跨和甲基化酶 ·在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。两个单链断裂部 位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。 (二)DNA连接酶 ·能够将DNA链上彼此相的3羟基(OH)和5'磷酸基团(-P),在NAD+或ATP供 能的作用下，形成磷酸二酯键。 ■只能连接切口(nick),不能连接缺口(p而且被连接的DNA链必需是双螺旋 DNA分子的一部分. 6

6 性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定 DNA 片段之间的结合区域。 ▪ 甲基化干扰实验：根据 DMS（硫酸二甲酯）能够使 G 残基甲基化，而六氢吡啶又能够 特异切割甲基化的 G 残基这一原理。这种技术可以检测靶 DNA 中特异 G 残基的优先甲基 化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA 与蛋白质之间 相互作用的模式。DMS 化学干扰的主要局限性时，它只能使 G 残基甲基化，但仍不愧为足 迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中 DNA 与蛋白质相互作用的精确位置。 第三章 基因工程的工具酶 重点：限制性内切酶、DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的生化特征、作用原理和应用领域。包括 Ⅱ型限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，大肠杆菌 DNA 连接酶，大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，Klenow 酶，T4 DNA 聚合酶，T7 DNA 聚合酶，反转录酶，Taq DNA 聚合酶，Pfu DNA 聚合酶和反转 录酶。T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。 难点：切口转移与核苷酸标记技术 （一）限制性内切酶和甲基化酶 ◼ 在 DNA 双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。两个单链断裂部 位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的 DNA 片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。 （二）DNA 连接酶 ◼ 能够将 DNA 链上彼此相邻的 3’-羟基（OH）和 5’-磷酸基团（-P），在 NAD+或 ATP 供 能的作用下，形成磷酸二酯键。 ◼ 只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的 DNA 链必需是双螺旋 DNA 分子的一部分

(三)DNA聚合酶 1.E.coli Pol1的特点 (1)具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的 片段，其中小片段具5'一3'外切酶活性，大片段具3'一5'外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦称为Klenow片段， (2)聚合酶活性 5'一3，要求3-OH引物和模板DNA,其延续性受反应条件的影响 2、Klenow片段 由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子.仍具有 5'→3的紧合酶活性和3→5'的外切酶活性，失去了全酶的5'→3'外切酶活性。 3、T4DNA聚合酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有5'一3'的 聚合酶活性和3一5'外切酶活性。5'一3聚合酶活性，1500nt/min,为Pol1的两倍 3→5外切酶活性，可作用于sDNA和ds DNA,其切除速度分别为40和400Ont/min 4、反转录聘 ■许多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反 转录酶(AMN) ■AMN具有a链和B链；a链具有聚合酶活性和RNase H活性；B链具有以RNA-DNA 杂交分子为底物的5'→3'脱氧核酸外切酶活性 5.T7DNA聚合酶 。1978年5.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌奇主细胞中纯化出来的一种聚合酶。 ■加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌体编码的基铟5蛋白质，另一种是大肠杆菌

7 （三）DNA 聚合酶 1、E.coli Pol I 的特点 （1）具两种外切酶活性和 DNA 聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的 片段，其中小片段具 5’→3’外切酶活性，大片段具 3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段 亦称为 Klenow 片段）。 （2）聚合酶活性 5’→3’, 要求 3’-OH 引物和模板 DNA，其延续性受反应条件的影响 2、Klenow 片段 由大肠杆菌 DNA 聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子。仍具有 5’→3’的聚合酶活性和 3’→5’ 的外切酶活性，失去了全酶的 5’→3’外切酶活性。 3、T4DNA 聚合酶 从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的 DNA 聚合酶，具有 5’→3’的 聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为 Pol I 的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于 ss DNA 和 ds DNA，其切除速度分别为 40 和 4000nt/min 4、反转录酶 ◼ 许多 RNA 肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反 转录酶（AMV） ◼ AMV 具有 α 链和 β 链；α 链具有聚合酶活性和 RNase H 活性；β 链具有以 RNA-DNA 杂交分子为底物的 5’→3’脱氧核酸外切酶活性 5、T7DNA 聚合酶 ◼ 1978 年，S. Tabor 从感染了 T7 噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种聚合酶。 ◼ 加工形式的 T7 DNA 聚合酶系：T7 噬菌体编码的基因 5 蛋白质，另一种是大肠杆菌

编码的硫氧还蛋白， ■基姻5蛋白质：具有聚合酶活性和3→5'外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因5蛋 白质与模板引物的结合力 具有5'→3的聚合酶活性和很高的单链及双链的3→5核酸外切酶活性 (四)DNA和RNA修饰酶 1、未端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 ■未末端脱氧核昔酸转移酶(terminal deoxynucleotidy transferase),从小牛胸腺中纯化 出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸 进行5'→3'方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3'-OH 末端。 2、T4多核苷酸激酶 ■由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E.co中分离出 来。作用：催化Y-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长 短限制。 3、来自于大肠杆菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛肠(calf intestinal alkaline phosphatase CIP), ■用于脱去DNA(RNA)5未端的磷酸基团，使5-P成为5-OH,该过程称核酸分子的脱 磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行 脱磷酸反应。 (五)核酸外切酶 ss DNA ds DNA 大肠杆葡外切摩】(eoI) 大备杆葡外切磨D(eo血) 大肠杆曹外切脑W(c和W) 嘘菌体按酸外切麝(c) T7壁菌体茶因6按酸外切鼻

8 编码的硫氧还蛋白。 ◼ 基因 5 蛋白质：具有聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因 5 蛋 白质与模板引物的结合力 ◼ 具有 5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的 3’ →5’核酸外切酶活性。 （四）DNA 和 RNA 修饰酶 1、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 ◼ 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），从小牛胸腺中纯化 出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸 进行 5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性 DNA 分子的 3’-OH 末端。 2、T4 多核苷酸激酶 ◼ 由 T4 噬菌体的 pseT 基因编码的一种蛋白质，最初从 T4 噬菌体感染的 E. coli 中分离出 来。作用：催化γ-磷酸从 ATP 分子转移给 DNA 或者 RNA 的末端，不受底物分子链的长 短限制。 3、来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP）， ◼ 用于脱去 DNA（RNA）5’末端的磷酸基团，使 5’-P 成为 5’-OH，该过程称核酸分子的脱 磷酸作用。当需要 5’端同位素标记或为了避免 DNA 片段自身连接（或环化）时可进行 脱磷酸反应。 （五）核酸外切酶 ss DNA ds DNA 大肠杆菌外切酶Ⅰ（exo Ⅰ） 大肠杆菌外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 大肠杆菌外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） λ噬菌体核酸外切酶（λexo） T7噬菌体基因6核酸外切酶

第四章原核生物基因工程的载体 重点：大肠杆菌质粒载体，包括pBR322和pUC18/19载体构建原理和应用领域，蓝/白筛选， 质粒DNA的制备和纯化；入噬菌体载体，包括入gt10/11和AEMBL3/4载体构建原理和应用领 域，入重组噬菌体的筛选；M13噬菌体载体，M13mp18/19构建原理和应用领域，单链DNA 的制备；粘粒载体pB8构建原理和应用领域。 难点：入重组DNA的转移和筛选 （一)质粒 质粒是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子(covalent closed circular,DNA CCCDNA),大小在120Okb,能独立进行复制。 1、氯化铯密度梯度离心 ·质粒DNA占总DNA的1%~2%： ·在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片新断，而质粒DNA 分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； ·染色剂澳化乙淀(EB)能入到DNA链的碱基中，导致链的解旋：而目形成的EB-DNA 复合物中，B含量越高，密度会越低。 2、碱变性法 ·根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出 来的

9 第四章 原核生物基因工程的载体 重点：大肠杆菌质粒载体，包括 pBR322 和 pUC18/19 载体构建原理和应用领域，蓝/白筛选， 质粒 DNA 的制备和纯化；λ噬菌体载体，包括λgt10/11 和λEMBL3/4 载体构建原理和应用领 域，λ重组噬菌体的筛选；M13 噬菌体载体，M13mp18/19 构建原理和应用领域，单链 DNA 的制备；粘粒载体 pJB8 构建原理和应用领域。 难点：λ重组 DNA 的转移和筛选 （一）质粒 质粒是细菌细胞内携带的染色体外的 DNA 分子，是共价闭合的环状 DNA 分子（covalent closed circular，DNA cccDNA)，大小在 1~200kb，能独立进行复制。 1、氯化铯密度梯度离心 ▪ 质粒 DNA 占总 DNA 的 1%～2%； ▪ 在细胞裂解及 DNA 分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒 DNA 分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； ▪ 染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到 DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB-DNA 复合物中，EB 含量越高，密度会越低。 2、碱变性法 ▪ 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展出 来的

·在pH值12.0~12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会 被变性。 ·通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确 迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cCcDNA的上清液，最后用乙醇沉淀 获得质粒DNA 3、质粒载体必须具备的基本条件 ·具有复制起点 自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。协助维持细胞内含有10~20个左右的质粒拷贝 ·具有抗菌素抗性 ·理想的质粒载体具有两种坑菌素抗性基因。以便为奇主细胞提供易于检测的表型性状做 为选择信号，而且在有关的限制酶位点上插入外源DNA后形成的质粒有一个选择标记. ·具有若干限制南切单一位点(MC心)： ·具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后（不超 过15灿)仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制南具有多重识别位点 的几率也较低；较高的烤贝数可获得大量的克隆基因 (二)噬菌体载体 1、入噬菌体的基因组结构 (1)cos位点 ·线性双链DNA分子两端各有一条12t组成的彼此完全互补的5突出单链 ·注入宿主后，粘性未端互补形成双链区，成为cos位点， 2、插入式载体 10

10 ▪ 在 pH 值 12.0～12.5 范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不会 被变性。 ▪ 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀， 获得质粒 DNA 3、质粒载体必须具备的基本条件 ▪ 具有复制起点 自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。协助维持细胞内含有 10～20 个左右的质粒拷贝 ▪ 具有抗菌素抗性 ▪ 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状做 为选择信号，而且在有关的限制酶位点上插入外源 DNA 后形成的质粒有一个选择标记。 ▪ 具有若干限制酶切单一位点（MCS）； ▪ 具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后（不超 过 15kb）仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点 的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因 （二）噬菌体载体 1、λ 噬菌体的基因组结构 （1）cos 位点 ▪ 线性双链 DNA 分子两端各有一条 12nt 组成的彼此完全互补的 5’突出单链 ▪ 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成为 cos 位点。 2、插入式载体