《分子生物学》课程教学资源（讲义）第九章 基因工程与干细胞工程

第九章基因工程与干细胞工程 引言 140多年前(1865)，在捷克莫勒温镇一个修道院里沉醉于豌豆杂交实验的Mendel也许 根本就没有想到，他提出的遗传因子在半个世纪后被Morgen定义为基因：194年Avcy证 明了基因的物质基础是DNA:20世纪50年代初Watson和Crick又揭示了DNA的分子结构： 70年代初DNA己可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。生命科 的飞速发 孕有了现代分子生物 术 一基因工程。今天，人们在超市货架上可以买到保持期很长 转基因土豆，“多利”克隆绵羊走出实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变 革。 一、基因工程的基本概今 现在，关于基因工程的概念，不同的学者和不同的专著有不同的解释，很难有一个标准 的、准确的和固定的概念，而且，随者学科的发展，其内涵还在不断的扩展和延伸。就现在 的学科发展情况，可作以下阐述。同时，有必要对其相关的几个概念作一阐述。 (一)遗传工程、基因工程与生物工程的定义 l、遗传工程(Genetie en 七十年代才开始发展起 的一门新技术，是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分 子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。也是遗传学和工程学相结合的一门技术 科学。借用工程技术上的概念和设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA分子进行按图施工的遗传操作，以求定向改造生物的遗传特性。这一先进技术的兴起， 标志若现代遗传学或生物科学已发展到定向控制和改造遗传或生物性状的新阶段。 遗传工程可分为狭义和 一义两种 ()狭义的遗传工程即基因工程 (2)广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等 2、基因工程(Genetic Engineering) 原称遗传工程，又称基因操作(gene manipulation)、重组DNA(recombinant DNA) 基因工程是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，将一种或多种生物体（供 体)的基因与 载体在体外进行拼接重组构建成杂种D NA乡 然后转入另一种生物体（受 体)内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状，获得新品种，生产新产品，或是 究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体 而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数NA病毒外，几乎所有生物的基因都存在 于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程亦称为 重组DNA转术(DNA Reco 另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制制 增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖(Molecular Cloning) 3、生物工程(Biotechnology), 又称生物技术、生物工艺学。也是20世纪0年代诞生的一门新型技术。是根据生物学 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而 利用生物体所具有的功能元件（如基因、蛋白质等）来提供商品或社会服务的一门综合性科 学技术 生物工程被看作为新技术的革命标志之一，它与电子信息技术、新材料和新能源等技术 并列，成为关系到人类生存和社会进步、发展的世界高技术领域的重要支柱。这不仅因为它 所研究与开发的对象是可以再生的生物资源，而且还因为它对当今人类面临的人口和食物

第九章 基因工程与干细胞工程 引言 140 多年前（1865），在捷克莫勒温镇一个修道院里沉醉于豌豆杂交实验的 Mendel 也许 根本就没有想到，他提出的遗传因子在半个世纪后被 Morgen 定义为基因；1944 年 Avery 证 明了基因的物质基础是 DNA；20 世纪 50 年代初 Watson 和 Crick 又揭示了 DNA 的分子结构； 70 年代初 DNA 已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。生命科学的飞速发展 孕育了现代分子生物学技术——基因工程。今天，人们在超市货架上可以买到保持期很长的 转基因土豆，“多利”克隆绵羊走出实验室，基因工程正在使整个人类生活方式发生重大变 革。 一、基因工程的基本概念 现在，关于基因工程的概念，不同的学者和不同的专著有不同的解释，很难有一个标准 的、准确的和固定的概念，而且，随着学科的发展，其内涵还在不断的扩展和延伸。就现在 的学科发展情况，可作以下阐述。同时，有必要对其相关的几个概念作一阐述。 （一）遗传工程、基因工程与生物工程的定义 1、 遗传工程（Genetic Engineering） 七十年代才开始发展起来的一门新技术，是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分 子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。也是遗传学和工程学相结合的一门技术 科学。借用工程技术上的概念和设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作，以求定向改造生物的遗传特性。这一先进技术的兴起， 标志着现代遗传学或生物科学已发展到定向控制和改造遗传或生物性状的新阶段。 遗传工程可分为狭义和广义两种： (1)狭义的遗传工程即基因工程 (2)广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等 2、基因工程（Genetic Engineering） 原称遗传工程，又称基因操作（gene manipulation）、重组 DNA（recombinant DNA）。 基因工程是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，将一种或多种生物体（供 体）的基因与载体在体外进行拼接重组构建成杂种 DNA 分子，然后转入另一种生物体（受 体）内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状，获得新品种，生产新产品，或是研 究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体 而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数 RNA 病毒外，几乎所有生物的基因都存在 于 DNA 结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是 DNA 分子，因此基因工程亦称为 重组 DNA 技术（DNA Recombination）。另外，DNA 重组分子大都需在受体细胞中复制扩 增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecular Cloning）。 3、生物工程（Biotechnology）， 又称生物技术、生物工艺学。也是 20 世纪 70 年代诞生的一门新型技术。是根据生物学、 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而 利用生物体所具有的功能元件（如基因、蛋白质等）来提供商品或社会服务的一门综合性科 学技术。 生物工程被看作为新技术的革命标志之一，它与电子信息技术、新材料和新能源等技术 并列，成为关系到人类生存和社会进步、发展的世界高技术领域的重要支柱。这不仅因为它 所研究与开发的对象是可以再生的生物资源，而且还因为它对当今人类面临的人口和食物

能源和资源以及环境和健康等迫切需要解决的问题发挥重要的作用，并展现了极其诱人的前 景。生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程等 (D基因工程(ene)又称基因操作(ene入重组DNA( DNA)。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导 入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和 功能」 (2)细胞工程()应用细胞生物学的原理和方法， 结 工程学的技术手段 按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖 细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、 染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微 生物工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。 (3)细胞分泌工程是根据细内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技 术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因 等措施，促进基因产物分泌的技术。 (4)酶工程(enzyme engineering)又称为酵技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性， 结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品：以及利用重组DNA 技术定向改变酶，进行的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的 固定化、酶反 应器等。 (5)蛋白质工程(protein engineering)是更「广义上的包括酶工程在内的蛋白质移饰梯作 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非自然蛋白质的技术。主要是 根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造 基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。 (6)发酵工程(f g eering)又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物 主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段，生产有用物质，或把微生物直接 用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育，发酵生产微生物，或植物细 胞的代谢产物，生产微生物菌体，最佳培养条件的优化组合等。 (7)干细胞工程(Stem cell engineering) 重点介绍基因工程与干细胞工程 二、基因工程的基本原理 作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。 为达到此目的，可从以下四个方面考虑。 (1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载 体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达 水平。这里涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这 些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平 (3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞 中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理 (4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产 效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反 应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节，这里涉及的是生物化

能源和资源以及环境和健康等迫切需要解决的问题发挥重要的作用，并展现了极其诱人的前 景。生物工程包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程等。 （1）基因工程（gene engineering）又称基因操作（gene manipulation）、重组 DNA（recombinant DNA）。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因（DNA 分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导 入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和 功能。 （2）细胞工程（cell engineering）应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段， 按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖 细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、 染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微 生物工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。 （3）细胞分泌工程是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技 术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因 等措施，促进基因产物分泌的技术。 （4）酶工程（enzyme engineering）又称为酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性， 结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品；以及利用重组 DNA 技术定向改变酶，进行酶的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的 固定化、酶反应器等。 （5）蛋白质工程（protein engineering）是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作， 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非自然蛋白质的技术。主要是 根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造 基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。 （6）发酵工程（fermentation engineering）又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物， 主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段，生产有用物质，或把微生物直接 用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育，发酵生产微生物，或植物细 胞的代谢产物，生产微生物菌体，最佳培养条件的优化组合等。 （7）干细胞工程（Stem cell engineering） 重点介绍基因工程与干细胞工程 二、基因工程的基本原理 作为现代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。 为达到此目的，可从以下四个方面考虑。 （1）利用载体 DNA 在受体细胞中独立于染色体 DNA 而自主复制的特性，将外源基因与载 体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达 水平。这里涉及到 DNA 分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学原理。 （2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这 些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。 （3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等 mRNA 的翻译调控元件，强化受体细胞 中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基因表达调控的分子生物学原理。 （4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产 效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反 应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节，这里涉及的是生物化

学工程学的基本理论体系 因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。 三、基因工程所需元件 (一)工只酶 基因工程中的许多工作都涉及到对DNA讲行切害割和重组，或对DNA讲行修饰或合成 这些工作都是通讨酶的作用来完成的。切割、合成、连接、修饰等各种工且酶都是必不可少 的。 1、限制 限制酶(restriction enzyme)是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类 酶能识别双链DNA内部特异位点并且裂解磷酸二脂键。 (1)限制酶的分类根据酶结构、作用及与DNA结合和裂解的特异性，将限制酶分为三 DNA。 县有限和D货物：这酒常在识别点下瑞0，p处切为 只别位点附近 制DNA 切 点很难预测。在基因克隆中，I型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶是DNA重组技 术中最重要的工具酶，它能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA,其切割位 点的序列可知、固定。通常所说的限制酶就是指这一类酶。 (2)限制路的命名 (3)限制酶的识别和切割位点通常是4~6碱基对，具有回文序列(palindrom)的DNA 片段，大多数酶是错位切制双链DNA,产生5'或3'粘性未端(stickyend)。 如EcoR I切割后产生5'粘性未端： (4)周功异源海 (5)同尾酶(isoaudamers) 2、修饰醇 基因工程中常用的工具酶有许多是对DNA和RNA分子未端进行剪切、补平、连接及化 学修饰的酶，常见的有以下几种： (1)DNA聚合酶I DNA聚合醇I是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量 为109kD。它能以DNA为模板，以4种脱氧核苷酸为底物以及Mg2的参与下，在引物的游 离3一0H上，形成3,5 -磷酸二酯键。该酶除有聚合酶活性外，尚有3'→5及5 3'核酸外切酶活性。由于它具有5”一3'核酸外切酶活性，当用缺口平移法((nick 标记DNA探针时，常用DNA聚合酶I。 用枯草杆茵蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为大小两个片段，大片段的分子量为76kD, 这个片段也称为Klenow片段(Klenow fragment)。它具有5'→3'聚合酶活性及3'→5' 外切酶活性，而失去了5'→3'外切酶活性。它具有的3一5'外切酶活性能保证DNA 复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。 Klenow片段的主要用途有：①补齐双链DNA的3'末端。②通过补齐3'端使3'未端标记 ③在cDNM克隆中，第二股链的合成。④DN序列分析。 (2)逆转录酶(reverse transcriptase)常用的逆转录酶有两种，禽类成骨细胞性白血病 病毒(AW)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(BLV)逆转录酶。逆转录酶以NA为模 板合成DNA,合成时需要4种脱氧核苷酸及引物，合成方向为5 →3延伸，无3→5 外切酶活性。 广泛用 以nRNA为模板合成cDN 构建 A文库 (3)T4DNA连接酶(T4DNA1 igase)T4DNA连接酶催化双链DNA一端3'-OH与另一双 链DNA的5'端磷酸根形成3'，5'一磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNM末端 连接起来

学工程学的基本理论体系。 因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。 三、基因工程所需元件 （一）工具酶 基因工程中的许多工作都涉及到对 DNA 进行切割和重组，或对 DNA 进行修饰或合成。 这些工作都是通过酶的作用来完成的。切割、合成、连接、修饰等各种工具酶都是必不可少 的。 1、限制酶 限制酶（restriction enzyme）是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类 酶能识别双链 DNA 内部特异位点并且裂解磷酸二脂键。 （1）限制酶的分类 根据酶结构、作用及与 DNA 结合和裂解的特异性，将限制酶分为三 型。Ⅰ型酶具有限制和 DNA 修饰作用，这种酶通常在识别位点下游 100～1000bp 处切割 DNA。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割 DNA，切割位 点很难预测。在基因克隆中，Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶是 DNA 重组技 术中最重要的工具酶，它能在 DNA 分子内部的特异位点识别和切割双链 DNA，其切割位 点的序列可知、固定。通常所说的限制酶就是指这一类酶。 （2）限制酶的命名 （3）限制酶的识别和切割位点 通常是 4～6 碱基对，具有回文序列（palindrom）的 DNA 片段，大多数酶是错位切割双链 DNA，产生 5＇或 3＇粘性未端（sticky end）。 如 EcoRⅠ切割后产生 5＇粘性未端： （4）同功异源酶 （5）同尾酶（isoaudamers） 2、修饰酶 基因工程中常用的工具酶有许多是对 DNA 和 RNA 分子未端进行剪切、补平、连接及化 学修饰的酶，常见的有以下几种： （1）DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅰ是从大肠杆菌中发现的第一个 DNA 聚合酶，分子量 为 109kD。它能以 DNA 为模板，以 4 种脱氧核苷酸为底物以及 Mg2+的参与下，在引物的游 离 3＇—OH 上，形成 3＇，5＇-磷酸二酯键。该酶除有聚合酶活性外，尚有 3＇→5＇及 5＇ →3＇核酸外切酶活性。由于它具有 5＇→3＇核酸外切酶活性，当用缺口平移法（nick translation） 标记 DNA 探针时，常用 DNA 聚合酶Ⅰ。 用枯草杆菌蛋白酶可将 DNA 聚合酶Ⅰ裂解为大小两个片段，大片段的分子量为 76kD， 这个片段也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。它具有 5＇→3＇聚合酶活性及 3＇→5＇ 外切酶活性，而失去了 5＇→3＇外切酶活性。它具有的 3＇→5＇外切酶活性能保证 DNA 复制的准确性，把 DNA 合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。 Klenow 片段的主要用途有：①补齐双链 DNA 的 3＇末端。②通过补齐 3＇端使 3＇末端标记。 ③在 cDNA 克隆中，第二股链的合成。④DNA 序列分析。 （2）逆转录酶（reverse transcriptase）常用的逆转录酶有两种，禽类成骨细胞性白血病 病毒（AMV）逆转录酶和 Moloney 小鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。逆转录酶以 RNA 为模 板合成 DNA，合成时需要 4 种脱氧核苷酸及引物，合成方向为 5＇→3＇延伸，无 3＇→5＇ 外切酶活性。广泛用于以 mRNA 为模板合成 cDNA，构建 cDNA 文库。 （3）T4DNA 连接酶（T4 DNA ligase） T4DNA 连接酶催化双链 DNA 一端 3＇-OH 与另一双 链 DNA 的 5＇端磷酸根形成 3＇，5＇-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的 DNA 末端 连接起来

(4)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)能去除DNA或NA5'瑞的磷酸根 制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 (5)末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase 简称末端 转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3'OH上，主要用于探针标记：或者在载体 和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 (6)Taq DNA聚合酶和其他耐热DNA聚合酶见PCR反应。 除此之外，还有T4多聚核苷酸激酶，RNA聚合酶，核酸酶等。 ( )载体 克隆载体：应用重组DNA技术克隆DNA片段时，通常采用大肠杆菌作为宿主细胞(hOg c©l)。所要克隆的目的DNA没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效 的方法将导入外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA 导入宿主细胞后，本身不能结宿主细胞的繁殖而自制，即没有自主复制能力，达不到使外源 DNA片段扩增的目的 如果要将外源DN 片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有 个能在该宿主细胞中进行自我复制和表达的载体(v©ctor)来携带，载体实际上也是DNA 外源DNA片段与载体在体外连接，构成DNA重组体，然后导入宿主细胞，使之进行扩增 或表达。以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体。 将常用克降载体中加入一些与表达调控有关的元件(DNA序列)，即成为表达载体，不 仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞中表达外源基因。 表达载 (expressing vec 是用来 表达（转录和翻译）外源基因的载 体。这类载体除具有克隆所具备的性质以外，还带有表达构件一 转录和翻译所必需的DNA 序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如大肠杆菌、分枝杆菌、放线菌、酵母、哺 乳动物细胞等，各有相应的表达载体。 四、因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部 分组成。前者主要在实验宽里进行，其单元操作过程如下： (I)从供体细胞中分离出基因组DNA,用限制性核酸内切酸酶分别将外源DNA(包括外 源基因成目的基因)和载体分子切开（简称切） (2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简 称接) (3)借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）： (4)短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简 称增)： 《5)篇洗和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程茵或细胞（简称拾） 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检 五、基因工程的发展历史 从基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同 生物米源的DNA分子的切制与连接、DNA拼接反应的检测方法以及重组DNA分子导入受 体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于20世纪0年代初发展起来的， 并迅速导致了第 个DNA体外重组实验的诞生 1.2.1基因工程的诞生 1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、A噬菌体基因以及大 肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人

（4）碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）能去除 DNA 或 RNA5＇端的磷酸根。 制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 （5）末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT） 简称末端 转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到 DNA 的 3＇-OH 上，主要用于探针标记；或者在载体 和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 （6）Taq DNA 聚合酶和其他耐热 DNA 聚合酶 见 PCR 反应。 除此之外，还有 T4 多聚核苷酸激酶，RNA 聚合酶，核酸酶等。 （二）载体 克隆载体：应用重组 DNA 技术克隆 DNA 片段时，通常采用大肠杆菌作为宿主细胞（host cell）。所要克隆的目的 DNA 没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效 的方法将导入外源 DNA 片段的细胞和没有导入外源 DNA 的细胞区分开来。此外，外源 DNA 导入宿主细胞后，本身不能随宿主细胞的繁殖而自制，即没有自主复制能力，达不到使外源 DNA 片段扩增的目的。如果要将外源 DNA 片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有 一个能在该宿主细胞中进行自我复制和表达的载体（vector）来携带，载体实际上也是 DNA。 外源 DNA 片段与载体在体外连接，构成 DNA 重组体，然后导入宿主细胞，使之进行扩增 或表达。以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、λ噬菌体、粘粒和 M13 噬菌体。 将常用克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA 序列），即成为表达载体，不 仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞中表达外源基因。 表达载体（expressing vector）：是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载 体。这类载体除具有克隆所具备的性质以外，还带有表达构件——转录和翻译所必需的 DNA 序列。根据受体细胞不同，表达载体多种多样，如大肠杆菌、分枝杆菌、放线菌、酵母、哺 乳动物细胞等，各有相应的表达载体。 四、因工程的基本过程 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部 分组成。前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组 DNA，用限制性核酸内切酸酶分别将外源 DNA（包括外 源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）； （2）用 DNA 连接酶将含有外源基因的 DNA 片段接到载体分子上，形成 DNA 重组分子（简 称接）； （3）借助于细胞转化手段将 DNA 重组分子导入受体细胞中（简称转）； （4）短时间培养转化细胞，以扩增 DNA 重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简 称增）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。 五、基因工程的发展历史 从基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同 生物来源的 DNA 分子的切割与连接、DNA 拼接反应的检测方法以及重组 DNA 分子导入受 体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于 20 世纪 70 年代初发展起来的， 并迅速导致了第一个 DNA 体外重组实验的诞生。 1.2.1 基因工程的诞生 1972 年美国 Berg 和 Jackson 等人将猿猴病毒基因组 SV40 DNA、λ噬菌体基因以及大 肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的 Cohen 和 Boyer 等人

在体外构建出含省四环素和结霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，移 重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宜告了基因工程的诞生。 )在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有 能使大肠杆菌具备其 他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能， 如光合作用和抗生素合成等 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的维 续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括Co本人在内的分子生物 学家们都相心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界制造出一个不而知的危险物种 1975年西欧几个国家签署公约 限制基因重组的实验规模 二年美国政府也制订了相应的法规。至今世界上仍有少数国家坚持对基因 且技术的应月 范围进行严格的限制。 然而，分子生物学家们毕竞不愿看到先讲的科学技术排送在自己手中。从192年到1976 年短短的四年里，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包 括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，同 时还建立了 套严格的DNA重组实验 计与操作规 范。众多安全可靠 关技 及巨大的潜在诱惑力，终于使DNA重组技术走出困境并迅速发展起来。 12.2基因工程的成熟 早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平 密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的牛理功能。197 年，日本的Tfahura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。 几个月后，美国的Uvch随即克隆表达了人的胰岛素基因。1978年 美国Genentech公司 开发出利用重组大肠杆菌合成2胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序 幕。 最近10年来又有数以百计的新型基因工程药物问世，另有400余种药物正处于研制开 发中。DNA组技术已溪渐取代经典的赏生物透弯有种程序，大大推讲了微生物种群的非 自然有益进化的进程 1.2.3基因工程的腾日 20世纪80年代以来，基因工程已开始朝若高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基 因治疗等方向发展。1982年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培有出具 白大鼠雄肆体魄的转基因小鼠及其子代。1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组雪质 粒转化植物细胞我 得成功 高等植物转基因技术问世。1990 年美国政府首次批准一项人体 基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进 行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。1991年，美国侣导在全球范围内实 施雄心勃勃的人类基因组计划，用15年时间斥资30亿美元，完成125000个人类基因的全 部测序工作。1994年底，一张覆盖整个基因组的人类遗传图谱己经完成，而高质量的物理 图谱也已覆盖了95%的基因组。1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利 如果借助于某种限制巧妙地避开论理道德方面的社会学问题，那么人类在实验室里复 制自身的尝试必将会产生无法估量的社会经济价值。 六、基因工程研究的意义 近半个世纪的分子生物学和分子遗传学研究结果表明，基因是控制一切生命运动的物质 形式。基因工程 本质是按照人们的设计蓝图 将生物体内控制性状的基因进行优化重组 并使其稳定遗传和表达。这一技术在超越生物王国种属界限的同时，简化了生物物种的进化 程序，大大加快了生物物种的进化速度，最终卓有成效地将人类生活品质提高到一个崭新的 水平。因此，基因工程诞生的意义毫不逊色于有史以来的任何一次技术革命

在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该 重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。 正如 Cohen 在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其 他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合作用和抗生素合成等。 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的继 续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括 Cohen 本人在内的分子生物 学家们都担心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界创造出一个不可预知的危险物种， 致使人类遭受灭顶之灾。于是，1975 年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模。 第二年美国政府也制订了相应的法规。至今世界上仍有少数国家坚持对基因重组技术的应用 范围进行严格的限制。 然而，分子生物学家们毕竟不愿看到先进的科学技术葬送在自己手中。从 1972 年到 1976 年短短的四年里，人们对 DNA 重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包 括噬菌体 DNA 载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，同 时还建立了一套严格的 DNA 重组实验室设计与操作规范。众多安全可靠的相关技术支撑以 及巨大的潜在诱惑力，终于使 DNA 重组技术走出困境并迅速发展起来。 1.2.2 基因工程的成熟 早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平 密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的生理功能。1977 年，日本的 Tfahura 及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。 几个月后，美国的 Ullvich 随即克隆表达了人的胰岛素基因。1978 年，美国 Genentech 公司 开发出利用重组大肠杆菌合成 2 胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序 幕。 最近 10 年来又有数以百计的新型基因工程药物问世，另有 400 余种药物正处于研制开 发中。DNA 重组技术已逐渐取代经典的微生物诱变育种程序，大大推进了微生物种群的非 自然有益进化的进程。 1.2.3 基因工程的腾飞 20 世纪 80 年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基 因治疗等方向发展。1982 年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培育出具 有大鼠雄健体魄的转基因小鼠及其子代。1983 年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组 Ti 质 粒转化植物细胞获得成功，高等植物转基因技术问世。1990 年美国政府首次批准一项人体 基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进 行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。1991 年，美国倡导在全球范围内实 施雄心勃勃的人类基因组计划，用 15 年时间斥资 30 亿美元，完成 125 000 个人类基因的全 部测序工作。1994 年底，一张覆盖整个基因组的人类遗传图谱已经完成，而高质量的物理 图谱也已覆盖了 95%的基因组。1997 年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利” 绵羊，如果借助于某种限制巧妙地避开论理道德方面的社会学问题，那么人类在实验室里复 制自身的尝试必将会产生无法估量的社会经济价值。 六、基因工程研究的意义 近半个世纪的分子生物学和分子遗传学研究结果表明，基因是控制一切生命运动的物质 形式。基因工程的本质是按照人们的设计蓝图，将生物体内控制性状的基因进行优化重组， 并使其稳定遗传和表达。这一技术在超越生物王国种属界限的同时，简化了生物物种的进化 程序，大大加快了生物物种的进化速度，最终卓有成效地将人类生活品质提高到一个崭新的 水平。因此，基因工程诞生的意义毫不逊色于有史以来的任何一次技术革命

概括地讲，基因工程研究与发展的意义体现在以下三个方面：第一，大规模生产生物分 子。利用细菌（如大肠杆茵和酵母等）基因表达调控机制相对简单和生长速度较快等特点 令其超量 合成其他生物体内含量极微但却是较高经济价值的系列化物质 。第 受计构建荔 物种。借助于基因重组、基因定向诱变甚至基因人工合成技术，创造出自然界中不存在的生 物新性状乃至全新物种。第三，搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源。目 前，日趋成熟的DNA重组技术己能使人们获得全部生物的基因组，并迅速确定其相应的生 物功能 13.1第四次工业大革命 1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股 票价格从3.5美元飙升到89美元，这是该证券交易所有史以来增值最快的一种股票。闹市 的铃声分明是在为一个伟大的产业技术革命而欢呼，因为上市前两年，该公司的科学家们克 隆了缩码胰岛素的基因。含有人糖岛素基因的大肠杆菌细胞就像一个个高效运转的生产车 间，制造出足以替代市面上短缺的猪胰岛素的重组人胰岛素) 这在当时被认为是医药界 个惊人奇 ,然而在今天看来，这种类型的基因工程产业似乎过于“小儿科 了。目前 已经投放市场以及正在研制开发的基因工程药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病 毒剂、抗癌因子、新型抗生素、重组疫苗、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急牧 药、生长因子以及诊断试剂等 食品添加剂的大规模生产 ]益显示出强大的园 高效表达可分泌型淀粉酶、纤维素 脂肪酶以及蛋白藓等酶制剂的重组薇生物也已分别在食品制造、纺织印染、皮革加工和日用 品生产中大显身手。传统化学工业中难以分离的混旋对映体，借助于基因工程菌可有效地进 行生物拆分。 能源始终是亚面制约人类生产活动的士要因素。以石油为代表的传统能源开采利用率的 提高以及新型能源的产业化是解决能源危机的希望所在。利用DNA重组技术构建的新型 生物在不久的将来可望大幅度提高石油的二次开采率和利用率，将难以利用的纤维素分解为 葡萄糖，并将太阳能有效地转化为化学能和热能。 环境保护是人类可持续生存与发展的大课题。一些能快速分解吸收工业有害废料、生物 转化工业右害气体以及全面净化工业和生活废水的基因工程微生物种群已从实验室走向三 废聚集地 在迅速发展的信息产业中，基因工程技术的应用也已崭露头角。利用基因定向诱变技术 可望制成运算速度更快、体积更小的蛋白芯片，人们装备使用生物电脑的时代己为期不远了。 1983年，羊国注册了大约200家以基因工程为主导的生物技术公司.今天这类公司已 超过了1500家。1986年全球基因工程产业的总销售额才600万美元，到1993年己增至34 亿美元，预计在20纪未将达到600亿美元，难怪日本政府将基因工程命名为“战路工业” 基因工程作为20世纪最后一次伟大的工业草命， 必将对新世纪产生深远的影响 1.3.2第二次农业大革命 基因工程技术在农林畜牧业中的应用范围广泛，意义重大。烟草、棉花等经济作物极易 遭受病虫害的侵袭，严重时导致绝产。利用重组微生物可以大规模生产对棉铃虫等有苦昆虫 具有剧毒作用的蛋白类农用杀虫剂，由于这类杀虫剂是可降解的生物大分子，不污染环境， 故有生物农药之称。将某些特殊基因转入植物 再生出的植株可表现出广谱抗病毒 真菌、细菌和线虫的优良性 状，从而减少或避免使用化学农药，达到既降低农业成本又杜绝 谷物、蔬莱和水果污染之目的。 基因工程也可用来政良农作物的品质。作为人类主食的水稻、小麦和土豆蛋白含量相对 较低，其中必需氨基酸更为缺乏，选用适当的基因操作手段提高农用物的营养价值正在研究

概括地讲，基因工程研究与发展的意义体现在以下三个方面：第一，大规模生产生物分 子。利用细菌（如大肠杆菌和酵母等）基因表达调控机制相对简单和生长速度较快等特点， 令其超量合成其他生物体内含量极微但却是较高经济价值的系列化物质。第二，设计构建新 物种。借助于基因重组、基因定向诱变甚至基因人工合成技术，创造出自然界中不存在的生 物新性状乃至全新物种。第三，搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源。目 前，日趋成熟的 DNA 重组技术已能使人们获得全部生物的基因组，并迅速确定其相应的生 物功能。 1.3.1 第四次工业大革命 1980 年 11 月 15 日，美国纽约证券交易所开盘的 20 分钟内，Genentech 公司的新上市股 票价格从 3.5 美元飙升到 89 美元，这是该证券交易所有史以来增值最快的一种股票。闹市 的铃声分明是在为一个伟大的产业技术革命而欢呼，因为上市前两年，该公司的科学家们克 隆了编码胰岛素的基因。含有人胰岛素基因的大肠杆菌细胞就像一个个高效运转的生产车 间，制造出足以替代市面上短缺的猪胰岛素的重组人胰岛素产品。这在当时被认为是医药界 的一个惊人奇迹，然而在今天看来，这种类型的基因工程产业似乎过于“小儿科”了。目前， 已经投放市场以及正在研制开发的基因工程药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病 毒剂、抗癌因子、新型抗生素、重组疫苗、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急救 药、生长因子以及诊断试剂等。 在轻工食品产业，与传统的诱变育种技术相比，基因工程在氨基酸、助鲜剂和甜味剂等 食品添加剂的大规模生产中日益显示出强大的威力。高效表达可分泌型淀粉酶、纤维素酶、 脂肪酶以及蛋白酶等酶制剂的重组微生物也已分别在食品制造、纺织印染、皮革加工和日用 品生产中大显身手。传统化学工业中难以分离的混旋对映体，借助于基因工程菌可有效地进 行生物拆分。 能源始终是严重制约人类生产活动的主要因素。以石油为代表的传统能源开采利用率的 提高以及新型能源的产业化是解决能源危机的希望所在。利用 DNA 重组技术构建的新型微 生物在不久的将来可望大幅度提高石油的二次开采率和利用率，将难以利用的纤维素分解为 葡萄糖，并将太阳能有效地转化为化学能和热能。 环境保护是人类可持续生存与发展的大课题。一些能快速分解吸收工业有害废料、生物 转化工业有害气体以及全面净化工业和生活废水的基因工程微生物种群已从实验室走向三 废聚集地。 在迅速发展的信息产业中，基因工程技术的应用也已崭露头角。利用基因定向诱变技术 可望制成运算速度更快、体积更小的蛋白芯片，人们装备使用生物电脑的时代已为期不远了。 1983 年，美国注册了大约 200 家以基因工程为主导的生物技术公司，今天这类公司已 超过了 1500 家。1986 年全球基因工程产业的总销售额才 600 万美元，到 1993 年已增至 34 亿美元，预计在 20 世纪未将达到 600 亿美元，难怪日本政府将基因工程命名为“战略工业”。 基因工程作为 20 世纪最后一次伟大的工业革命，必将对新世纪产生深远的影响。 1.3.2 第二次农业大革命 基因工程技术在农林畜牧业中的应用范围广泛，意义重大。烟草、棉花等经济作物极易 遭受病虫害的侵袭，严重时导致绝产。利用重组微生物可以大规模生产对棉铃虫等有害昆虫 具有剧毒作用的蛋白类农用杀虫剂，由于这类杀虫剂是可降解的生物大分子，不污染环境， 故有生物农药之称。将某些特殊基因转入植物细胞内，再生出的植株可表现出广谱抗病毒、 真菌、细菌和线虫的优良性状，从而减少或避免使用化学农药，达到既降低农业成本又杜绝 谷物、蔬菜和水果污染之目的。 基因工程也可用来改良农作物的品质。作为人类主食的水稻、小麦和土豆蛋白含量相对 较低，其中必需氨基酸更为缺乏，选用适当的基因操作手段提高农用物的营养价值正在研究

之中。一些易腐烂的蔬菜水果如番茄、柿子等也能通过DNA重组技术改变原来的性状，从 而提高货架存放期。利用基因工程方法还可在暖房里按照人们的偏爱改变花卉的造型和颜 使之更具观赏性 天然环境压力对农作物生长影响极为严重。细胞分子生物学研究结果表明，对某些基因 进行结构修饰，提高植物细胞内的渗透压，可在很大程度上增强农作物的抗早、耐盐能力， 提高单位面积产量，同时扩大农作物的可耕作面积 在家畜品种政良方面，基因工程技术同样大有用武之地，其中最主要的成果是动物生长 方法生产自 生长激 使奶牛大量分泌高蛋白乳 汁， 大为缩短 且味道鲜美 、鸡饲料的利用率提高且瘦肉比重增力 近0年来，豆科植物固氮机制的研究方兴未艾，科学家们试图将某些细菌中的固氮基巴 移植到非豆科植物细胞内，使其表达出相应的性状。由于固氮基因组结构庞大，表达调控机 制复杂，目前尚未取得突破进展，但这项宏伟计划一旦实现，无疑将是第二次绿色大革命 科手术是一次医学革命 那么基因疗法则为医学带来了又 一次大革命 ,目 前临床上已鉴定出2000多种遗传病，其中相当一部分在不久以前还是不治之症，如血友病， 先天性免疫缺陷综合症等。随着医学和分子遗传学研究的不断深入，人们逐渐认识到，遗传 病其实只是基因突变综合症（分子病）中的一类。从更广泛的意义上讲，目前一些严重威胁 人类韩唐的所谓“文明病”或“富贵病”，加心脑血管病、尿病、癌症、过度胖综合定 老年性痴呆症、 骨质松完。均属分子病节。 分子病的治疗方法主要有两种： 期向志者体内输入病变基因的原始产物，以对抗由病变基因造成的危害： 二是利用基因转移 技术更换病变基因，达到标本兼治的目的。目前上述两大领域均取得了突破性的进展。 基因疗法实施的前提条件是对人类病变基因的精确认识，因而揭示从体125000个基因 的全部奥移具有极大的透感力。美国一家生物技术公司不惜花费几千万美元的重金从分子生 物学家手中买断刚刚克隆鉴定的肥胖基因，其意义可见一斑。随者本世纪第二个曼哈顿工程 人类基因组计划的实施 “本厚达几百万页的人类基因大词典即将问世，这些价值连城 的人类遗传信息资源的所有权究竟归谁，必是新世纪人们关注的热点之 新陈代谢是生物界最普遍的法则，然而细胞乃至生命终结的机制却是量个极有价值的例 题。最近有迹象表明，科学家们可能己经找到了控制细胞寿命的关键基因- -端粒酶编码基 因。也许有一天，人们借助于基因工程手段可以巧妙地操纵该基因的开关，使得日趋衰老的 细胞、 组织、器官甚至生命重新焕发出青春的光彩 第二部分：细胞与干细胞工程(Stem cell engineering） 处于分化过程之中，具有分裂增殖能力、并能分化产生一种以上“专业”细胞的原始 胞称为干细胞(stmc1)。然而，在发有过程中，可存在处于不同“分化等级”的干细胞 如存在于囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)中的细胞具有分化为机体任何一种组织器官 的潜能，习惯上称之为胚胎干细胞(embrvonic stem cell.ES细胞)。由于这种干细胞的分化 潜能很“宽”，故认为它们是个体发育中“等级”较高的干细胞：而存在于成熟个体各种组 织器官中的干细 具有自我更新能力，但通常只能分化为相 或相 邻)组 只器官组成 “专业”细胞，称为成体干细胞(somatic stem cel)。其分化潜能较“窄”，故认为，这样的 干细胞在个体发有中“等级”较低

之中。一些易腐烂的蔬菜水果如番茄、柿子等也能通过 DNA 重组技术改变原来的性状，从 而提高货架存放期。利用基因工程方法还可在暖房里按照人们的偏爱改变花卉的造型和颜 色，使之更具观赏性。 天然环境压力对农作物生长影响极为严重。细胞分子生物学研究结果表明，对某些基因 进行结构修饰，提高植物细胞内的渗透压，可在很大程度上增强农作物的抗旱、耐盐能力， 提高单位面积产量，同时扩大农作物的可耕作面积。 在家畜品种改良方面，基因工程技术同样大有用武之地，其中最主要的成果是动物生长 激素的广泛使用。注射或喂养由基因工程方法生产的生长激素，可使奶牛大量分泌高蛋白乳 汁，鱼虾生长期大为缩短且味道鲜美，猪、鸡饲料的利用率提高且瘦肉比重增加。 近 10 年来，豆科植物固氮机制的研究方兴未艾，科学家们试图将某些细菌中的固氮基因 移植到非豆科植物细胞内，使其表达出相应的性状。由于固氮基因组结构庞大，表达调控机 制复杂，目前尚未取得突破进展，但这项宏伟计划一旦实现，无疑将是第二次绿色大革命。 1.3.3 第四次医学大革命 如果说麻醉外科手术是一次医学革命，那么基因疗法则为医学带来了又一次大革命。目 前临床上已鉴定出 2 000 多种遗传病，其中相当一部分在不久以前还是不治之症，如血友病、 先天性免疫缺陷综合症等。随着医学和分子遗传学研究的不断深入，人们逐渐认识到，遗传 病其实只是基因突变综合症（分子病）中的一类。从更广泛的意义上讲，目前一些严重威胁 人类健康的所谓“文明病”或“富贵病”，如心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、 老年性痴呆症、骨质疏松症等等，均属分子病范畴。分子病的治疗方法主要有两种：一是定 期向患者体内输入病变基因的原始产物，以对抗由病变基因造成的危害；二是利用基因转移 技术更换病变基因，达到标本兼治的目的。目前上述两大领域均取得了突破性的进展。 基因疗法实施的前提条件是对人类病变基因的精确认识，因而揭示从体 125 000 个基因 的全部奥秘具有极大的诱惑力。美国一家生物技术公司不惜花费几千万美元的重金从分子生 物学家手中买断刚刚克隆鉴定的肥胖基因，其意义可见一斑。随着本世纪第二个曼哈顿工程 ——人类基因组计划的实施，一本厚达几百万页的人类基因大词典即将问世，这些价值连城 的人类遗传信息资源的所有权究竟归谁，必是新世纪人们关注的热点之一。 新陈代谢是生物界最普遍的法则，然而细胞乃至生命终结的机制却是量个极有价值的例 题。最近有迹象表明，科学家们可能已经找到了控制细胞寿命的关键基因——端粒酶编码基 因。也许有一天，人们借助于基因工程手段可以巧妙地操纵该基因的开关，使得日趋衰老的 细胞、组织、器官甚至生命重新焕发出青春的光彩。 第二部分： 细胞与干细胞工程（Stem cell engineering） 一、干细胞的概念 处于分化过程之中，具有分裂增殖能力、并能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细 胞称为干细胞（stem cell）。然而，在发育过程中，可存在处于不同“分化等级”的干细胞。 如存在于囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）中的细胞具有分化为机体任何一种组织器官 的潜能，习惯上称之为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES 细胞）。由于这种干细胞的分化 潜能很“宽”，故认为它们是个体发育中“等级”较高的干细胞；而存在于成熟个体各种组 织器官中的干细胞，具有自我更新能力，但通常只能分化为相应（或相邻）组织器官组成的 “专业”细胞，称为成体干细胞（somatic stem cell）。其分化潜能较“窄”，故认为，这样的 干细胞在个体发育中“等级”较低

二、干细胞的特征 1、干细胞的形态和生化特征 作为有分裂增殖能力的细胞， 干细胞在形态上有一些共性。细胞通常呈圆形或椭圆形 体积较小，核质比相对较大。不同种类的干细胞生化特征各有差异，但都具有比较高的端粒 酶活性，这与其增殖能力是密：切相关的。 2、干细胞的增殖特征 ()增殖的缓慢性干细胞通常分裂缓慢，有利于干细胞对特定外界信号作出反应，以决 定是增殖还是分化 减少 (②)增殖系统的自稳定性即干细胞可在生物个体生命区间中自我更新，并维持其自身数 目恒定。 3、干细胞的分化特征 (1)干细胞的分化潜能在卵子受精后，受精卵分裂成多个完全一样的全能性细胞，将 这些细胞中的任何 一个，放到女性的子宫内，都可发育为胚胎，这种细胞和受精卵统称为全 能性(totipotent)干细胞。受精卵细胞经若干次分裂后，形成胚泡。胚泡中的内细胞团到 胞也称胚胎干细胞，可以分化为任何一种组织类型的细胞，称之为具有多能性 (pluripotent),但不能分化为生物个体。 (2)干细胞的转分化和去分化 一直以来，成体干细胞被认为只能向一种类型或与之 密切相关的细胞分化， 化 不能分化成其他类 加袖兴能向神多系统变糖织神学歌跑)公 胞。但是最近 些发现对这 越来越多的证 表明自成体分离的干细胞仍然具有相当的可塑性： 4、干细胞增殖与分化的微环境 (1)分泌因子 为数众多分泌因子(secreted factor)对干细胞的生存、增殖和分化 具有重要的调控作用。 (2)受体介导的细胞间相互作用 细胞间的相互作用对干细胞命运的调控具有重要意 义。尽管己经发现了许多细胞间粘附结构的组成分子，但是细胞间粘附对干细胞发有调节作 用的分子机制目前认识不多， (3)整合素和胞间基质 细胞对胞间基质的附着可以由多种受体介导，目前认识最多的 是整合素。 、干细胞的种类 1、胚胎干细胞 胚胎干细胞是指存在于早期胚胎中，具有多分化潜能的细胞。胚胎干细胞可以在体外无 限扩增并保持未分化状态，具有分化为胎儿或成体动物各种细胞类型的热能。胚胎干细胞可 以像普通的细胞那样，进行体外培养传代、遗传操作和冻存但不失去其多能性。在适当条件 细胞可被诱导分化为多利 也可以与受体胚胎形成嵌合体。因此 胚胎干细胞 是进行哺乳动物早期胚胎发生、细胞分化、基因功能、基因表达调控等研究的理想模型和有 效工具 2。结原干细尾制 在哺到动物的整个生命周期中，生殖细胸难持了种间的延续性。原始生殖细胞包绕在生 精索中逐渐分化为生精母细胞，它是精原干细胞的前体细胞，以后发有为成体精原干细胞 3、成体干细胞 在成体组织或器官中，许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血 液细胞和皮肤细胞：此外在损伤情况下，肝等组织也表现出明确的补充受损死亡细胞的能力

二、干细胞的特征 1、干细胞的形态和生化特征 作为有分裂增殖能力的细胞，干细胞在形态上有一些共性。细胞通常呈圆形或椭圆形， 体积较小，核质比相对较大。不同种类的干细胞生化特征各有差异，但都具有比较高的端粒 酶活性，这与其增殖能力是密切相关的。 2、干细胞的增殖特征 (1)增殖的缓慢性 干细胞通常分裂缓慢，有利于干细胞对特定外界信号作出反应，以决 定是增殖还是分化；减少基因突变危险。 (2)增殖系统的自稳定性 即干细胞可在生物个体生命区间中自我更新，并维持其自身数 目恒定。 3、干细胞的分化特征 （1）干细胞的分化潜能 在卵子受精后，受精卵分裂成多个完全一样的全能性细胞，将 这些细胞中的任何一个，放到女性的子宫内，都可发育为胚胎，这种细胞和受精卵统称为全 能性（totipotent）干细胞。受精卵细胞经若干次分裂后，形成胚泡。胚泡中的内细胞团细 胞也称胚 胎干 细胞， 可以分 化为任 何一 种组织 类型的 细胞， 称之 为具有 多能性 （pluripotent），但不能分化为生物个体。 （2）干细胞的转分化和去分化 一直以来，成体干细胞被认为只能向一种类型或与之 密切相关的细胞分化，如神经干细胞只能向神经系统细胞（神经元细胞、神经胶质细胞）分 化而不能分化成其他类型细胞。但是最近一些发现对这一诊断提出了挑战。越来越多的证据 表明自成体分离的干细胞仍然具有相当的可塑性。 4、干细胞增殖与分化的微环境 （1）分泌因子 为数众多分泌因子（secreted factor）对干细胞的生存、增殖和分化 具有重要的调控作用。 （2）受体介导的细胞间相互作用 细胞间的相互作用对干细胞命运的调控具有重要意 义。尽管已经发现了许多细胞间粘附结构的组成分子，但是细胞间粘附对干细胞发育调节作 用的分子机制目前认识不多。 （3）整合素和胞间基质 细胞对胞间基质的附着可以由多种受体介导，目前认识最多的 是整合素。 三、干细胞的种类 1、胚胎干细胞 胚胎干细胞是指存在于早期胚胎中，具有多分化潜能的细胞。胚胎干细胞可以在体外无 限扩增并保持未分化状态，具有分化为胎儿或成体动物各种细胞类型的潜能。胚胎干细胞可 以像普通的细胞那样，进行体外培养传代、遗传操作和冻存但不失去其多能性。在适当条件 下胚胎干细胞可被诱导分化为多种细胞，也可以与受体胚胎形成嵌合体。因此，胚胎干细胞 是进行哺乳动物早期胚胎发生、细胞分化、基因功能、基因表达调控等研究的理想模型和有 效工具。 2、精原干细胞 在哺乳动物的整个生命周期中，生殖细胞维持了种间的延续性。原始生殖细胞包绕在生 精索中逐渐分化为生精母细胞，它是精原干细胞的前体细胞，以后发育为成体精原干细胞。 3、成体干细胞 在成体组织或器官中，许多细胞仍具有自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血 液细胞和皮肤细胞；此外在损伤情况下，肝等组织也表现出明确的补充受损死亡细胞的能力

所以一直推测在成体中也存在一些能起新旧更替作用的成体干细胞的存在。目前较为明确的 有以下几种：造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、肠干细胞、肝干细胞. 干细胞工程 众所周知，包括人类在内的哺乳动物早期胚胎体积小，又在母体子宫内发有，因此，在 体内对胚胎发育和各类细胞的分化及其机制进行实验研究几乎是不可能的。从20世纪六七 十年代开始，人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖，又具有胚胎细胞全能性或多能性 的、并通过话当条件能被诱导分化为名种举刑分化细购的实验模型。（一）干细胞的培养建 系和基本特性 1、S(胚胎干细胞)和G(胚胎生殖细胞)细胞培养建系 设计和调整体外培养体系的生长微环境或条件，是干细胞建系成败的关键。 2、形态学特征和细胞的标表分子 前已述及 3、发有全能性和分化潜能 (一)FSCG细体外透导分化 S细胞体外可能被诱导分化的几种细胞 1、造血细胞 2、内皮细胞与血管发生 3、神经细胞 4、心肌和其他肌肉细胞 5、脂肪细胞 6、软骨细胞 S细胞工程正在发展成为动物细胞工程中最为活跃的分支

所以一直推测在成体中也存在一些能起新旧更替作用的成体干细胞的存在。目前较为明确的 有以下几种：造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、肠干细胞、肝干细胞. 四、干细胞工程 众所周知，包括人类在内的哺乳动物早期胚胎体积小，又在母体子宫内发育，因此，在 体内对胚胎发育和各类细胞的分化及其机制进行实验研究几乎是不可能的。从 20 世纪六七 十年代开始，人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖，又具有胚胎细胞全能性或多能性 的、并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。（一）干细胞的培养建 系和基本特性 1、ES（胚胎干细胞）和 EG（胚胎生殖细胞）细胞培养建系 设计和调整体外培养体系的生长微环境或条件，是干细胞建系成败的关键。 2、形态学特征和细胞的标志分子 前已述及 3、发育全能性和分化潜能 （二）ES/EG 细胞体外诱导分化 ES 细胞体外可能被诱导分化的几种细胞： 1、造血细胞 2、内皮细胞与血管发生 3、神经细胞 4、心肌和其他肌肉细胞 5、脂肪细胞 6、软骨细胞 ES 细胞工程正在发展成为动物细胞工程中最为活跃的分支