四川农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验讲稿）02 正交法测定几种因素对酶活力的影响

回川裳掌大学 生命科學學院 Sichuan Agricultural University College of Life Science 实验二 正交法测定几种因素对酶活 力的影响 生化与分子生物学实验室

实验二 正交法测定几种因素对酶活 力的影响 生化与分子生物学实验室

目录 Contents 一、 实验目的 二、实验原理设计 三、实验药品仪器 四、实验步骠 五、结果分析 六、注意事项

C o n t e n ts 五、结果分析 Ø . 一、实验目的 Ø . Ø . Ø . 二、实验原理设计 三、实验药品仪器 四、实验步骤 Ø . Ø . 六、注意事项

实验目的 1.学习影响酶促反应的因素 2.掌握正交法的原理和实验设计 3.学习胰蛋白酶酶活力的测定方法及Folin-酚蛋 白质定量法

、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度，并川．各因索之间也 相互影响（交互作川） 一 、实验目的 1. 学习影响酶促反应的因素 2. 掌握正交法的原理和实验设计 3. 学习胰蛋白酶酶活力的测定方法及 Folin-酚蛋 白质定量法

二、 实验原理 影响酶作用的因素 底物浓度、酶浓度、温度、p州值、激活剂和抑制剂等都能影 响酶反应速度，并且各因素之间也有相互影响（交互作用）。 1)底物浓度对酶反应速度的影响 V[S] 2)酶浓度对酶反应速度的影响 米氏方程： V= K+[S] D _Ym------ 零级反应 A:反应速度和南浓度成正比 混合级反应 B:底物浓度不足 C:底物中有不可逆抑制剂布在 D:酶液中有可逆抑制剂存在 一级反应 E

酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 二、实验原理 影响酶作用的因素 底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影 响酶反应速度，并且各因素之间也有相互影响（交互作用）

实验原理 影响酶作用的因素 4)pH对酶反应速度的影响 3)温度对酶反应速度的影响 最适温度 (optimum temperature) 酶反应的最适pH(optimum pH) 木瓜蛋白 力 20 50 10n 4种酶的活力一H曲线

酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验原理 影响酶作用的因素

实验原理 影响酶作用的因素 激活剂：凡是能提高酶活性，加速酶促反应进行的物质，分 必需和非必需激活剂。包括()无机离子，如金属离子(K+, Mg2+,Ca2+等)、阴离子(Br、C等)、氢离子等；(2)有机分子， 如谷胱甘肽，乙二胺四乙酸(EDTA)等；(3)蛋白质等生物大分 子，如对酶原激活。 抑制剂：能降低酶活力甚至使酶活完全丧失的物质。能引起 这种抑制作用的物质称为某酶的抑制剂（inhibitor).。分为： 不可逆抑制作用和可逆抑制作用

酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 激活剂：凡是能提高酶活性，加速酶促反应进行的物质，分 必需和非必需激活剂。包括(1)无机离子，如金属离子(K+ ， Mg2+ ，Ca2+等)、阴离子(Br -、Cl -等)、氢离子等；(2)有机分子， 如谷胱甘肽，乙二胺四乙酸(EDTA)等；(3)蛋白质等生物大分 子，如对酶原激活。 抑制剂：能降低酶活力甚至使酶活完全丧失的物质。能引起 这种抑制作用的物质称为某酶的抑制剂（inhibitor）。分为： 不可逆抑制作用和可逆抑制作用。 实验原理 影响酶作用的因素

实验原理 2.正交实验设计 )正交法是利用正交表来安排多因素试验、寻求最优水平组 合的一种高效率试验设计方法。它从多因素试验的全部水平 组合中挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部 分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优水平组合。 2)正交法的优点：符合实验设计原则“以尽量少的实验，获得 足够的、有效的信息” 正交表的列数（因素个数 正交表代号 +L4(23) 水平数 正交表的行数（试验数）

酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验原理 2. 正交实验设计 1)正交法是利用正交表来安排多因素试验、寻求最优水平组 合的一种高效率试验设计方法。它从多因素试验的全部水平 组合中挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部 分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优水平组合。 2)正交法的优点：符合实验设计原则“以尽量少的实验，获得 足够的、有效的信息

实验原理 2.正交实验设计 3)正交表的正交性 表中每一列（因素）各水平的重复数相等 表中任意两列横向形成的有序数对中，所有各种可能的有序数对的 重复数相同。用正交表安排的实验，具有均衡分散的特点。即按正 交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布式均衡的。 L4正交表 常用正交表按水平数可分为 C 二水平：L2,Lg2),L2,L16(2,… 三水平：L(3,L231,… 3 2 2 四水平：L16(4,… 五水平：L25(5,…

3)正交表的正交性 I表中每一列(因素)各水平的重复数相等 II表中任意两列横向形成的有序数对中，所有各种可能的有序数对的 重复数相同。用正交表安排的实验，具有均衡分散的特点。即按正 交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布式均衡的。 实验原理 2. 正交实验设计

实验原理 2.正交实验设计 4)正交实验的一般步骤 ()确定实验目的，实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最 佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了找到胰蛋白酶的 最适反应条件。 (②)选择质量特性指标，应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。 对于本实验来说就是产物（氨基酸或者肽）生成量的多少。 (③)选定相关因素，即选择确定可能对实验结果或质量特性值有影响的、 并可人为控制的因素，如温度、pH等。各因素之间有相对独立性

4)正交实验的一般步骤 (1)确定实验目的，实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最 佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了找到胰蛋白酶的 最适反应条件。 (2)选择质量特性指标，应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。 对于本实验来说就是产物(氨基酸或者肽)生成量的多少。 (3)选定相关因素，即选择确定可能对实验结果或质量特性值有影响的、 并可人为控制的因素，如温度、pH等。各因素之间有相对独立性。 实验原理 2. 正交实验设计

实验原理 2.正交实验设计 (4)确定水平，水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考 虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择37C、 50℃、60C三个水平。 (⑤)选用合适正交表，从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考 察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用 2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。 如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表

(4)确定水平，水平也就是因素変化的各种状态。在确定水平时，应考 虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择37℃、 50℃、60℃三个水平。 (5)选用合适正交表，从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考 察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用 2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。 如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。 实验原理 2. 正交实验设计