南京农业大学：《兽医免疫学》实验课程教学课件（PPT讲稿）实验四 酶联免疫吸附试验（ELISA）

南京发业大学NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY实验四酶联免疫吸附试验(ELISA)

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 实验四 酶联免疫吸附试验 （ELISA）

南京发业大学实验目的NANJING AGRICULTURALUNIVERSITY掌握ELISA的操作方法了解ELISA在动物疫病诊断中的意义

一、实验目的 NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY ◆掌握ELISA的操作方法 ◆了解ELISA在动物疫病诊断中的意义

二、实验原理南京发业大学NANJING AGRICULTURALUNIVERSITY免疫酶技术(enzyme immunoassay)是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应的敏感性相结合而建立的一种免疫检测技术。利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。*化学比色法敏感度为mg/mL；免疫酶技术敏感度为μg/mL

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 二、实验原理 免疫酶技术(enzyme immunoassay) 是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反 应的敏感性相结合而建立的一种免疫检测技术。 利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体 的一种免疫学标记技术。 *化学比色法敏感度为mg/mL；免疫酶技术敏感度为μg/mL

南京发业大学NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY酶联免疫吸附试验（ELISA）(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)是一类常用的免疫酶技术，是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。固相表面：酶标板、酶标条（聚苯乙烯材料）常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 酶联免疫吸附试验（ELISA） (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 是一类常用的免疫酶技术，是将已知的抗原或抗体吸附 在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 固相表面：酶标板、酶标条 （聚苯乙烯材料） 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）

常见的酶联免疫吸附试验南京发业大学NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITYAb3·直接法AblAb2Me-Ag·间接法AblAblA间接法夹心法双夹心法·(双)夹心法·竞争法Ab.F·阻断法AbAbAb试验组 酶标抗原竞争法对照组酶-抗酶抗体法图16-3酶联免疫吸附试验（ELISA）的类型Ag为抗原；Abl为特异性抗体；Ab2为抗抗体：Ab3为用另一种动物制备的特异性抗体；Ab·E为酶与抗酶抗体复合物；E为酶；黑色小点为底物酶解后的色素，白色小环为未酶解的底物

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY • 直接法 • 间接法 • (双)夹心法 • 竞争法 • 阻断法 常见的酶联免疫吸附试验

血清稀1.包被抗原A抗原2释X2.洗涤、封闭度83.加待检抗体16抗体324.洗涤641285.加酶标抗体酶标抗体2566.洗涤5121024C7.加底物显色阳性对照o0o底物阴性对照8.观察结果福酶联免疫吸附试验（ELISA，间接法）

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间接ELISA一般步骤包被抗原洗涤封闭洗涤一抗：待测血清洗涤酶标二抗洗涤结果底物显色终止判定

间接ELISA一般步骤 酶标二抗 包被抗原 一抗： 待测血清 底物显色 洗涤 封闭 洗涤 洗涤 终止 结果 判定 洗涤

三实验步骤1.包被：目的：使抗原非特异地吸附在酶标条孔底包被液：pH9.6碳酸盐缓冲液抗原（纯化的蛋白）用包被液稀释至2μug/mL，每孔加100uL。酶标条湿盒中，4℃过夜或 37℃,30min

三、实验步骤 1. 包被： 目的：使抗原非特异地吸附在酶标条孔底 抗原（纯化的蛋白）用包被液稀释至2 μg/mL， 每孔加100μL。 包被液 ：pH9.6碳酸盐缓冲液 酶标条 湿盒中，4℃过夜 或 37 ℃ , 30min

2.洗涤：用洗涤液（PBST：PBS+0.5%oTween-20，pH7.4）洗板3次（将洗板液加满每孔，静置5min后倾去），洗去未包被的游离抗原。洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。洗涤作用：清除残留在板孔中游离的，未结合的多余物质，以免干扰后续的反应。可以说在ELISA操作中，洗涤是关键步骤。在ELISA每个反应步骤之后，下一个反应之前均要进行充分的洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。 洗涤作用：清除残留在板孔中游离的，未结合的多余物质，以 免干扰后续的反应。可以说在ELISA操作中，洗涤是关键步骤 。在ELISA每个反应步骤之后，下一个反应之前均要进行充分 的洗涤。 2. 洗涤： 用洗涤液（PBST：PBS +0.5‰Tween-20 ，pH 7.4） 洗板3次（将洗板液加满每孔，静置5min后倾去），洗去 未包被的游离抗原

3.封闭（blocking）将封闭液（5%脱脂乳的PBST）加满孔（约350μl），37℃, 30 min。封闭是继包被之后用高浓度无关蛋白质溶液再包被的过程。原理：封闭液中大量无关的蛋白可以非特异性地将酶标板中没有结合包被抗原的空隙填满，后续步骤中加入的物质不会再与板子发生非特异性的结合

3. 封闭(blocking) 将封闭液（5%脱脂乳的PBST）加满孔（约350μl）， 37℃ ，30 min。 封闭是继包被之后用高浓度无关蛋白质溶液再包被 的过程。 原理： 封闭液中大量无关的蛋白可以非特异性地将酶标板中没有 结合包被抗原的空隙填满，后续步骤中加入的物质不会再 与板子发生非特异性的结合