南京农业大学：《兽医免疫学》实验课程教学课件（PPT讲稿）实验三 双向琼脂扩散实验

NANJING AGRICULTURALUNIVERSITY实验三双向琼脂扩散实验

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 实验三 双向琼脂扩散实验

一、实验原理NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY·沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合在电解质存在条件下，经过一定时间，即可形成肉眼可见的白色沉淀物。·可溶性抗原：蛋白质、酶类、补体、细菌毒素、核酸等·颗粒性抗原：细菌、各种细胞、寄生虫等

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY • 沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合， 在电解质存在条件下，经过一定时间，即可 形成肉眼可见的白色沉淀物。 • 可溶性抗原：蛋白质、酶类、补体、细菌毒素、核酸等 • 颗粒性抗原：细菌、各种细胞、寄生虫等 一、实验原理

琼脂凝胶扩散试验NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY，将可溶性抗原和抗体分别加入至琼脂凝胶板内的相邻小孔中，两者相互扩散，当抗原抗体分子柜遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集，出现白色的沉淀线，从而判定相应的抗体和抗原。双向单扩散（simplediffusionintwodimension )·双向双扩散（doublediffusionintwodimension )

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 琼脂凝胶扩散试验 • 将可溶性抗原和抗体分别加入至琼脂凝胶板内的 相邻小孔中，两者相互扩散，当抗原抗体分子相 遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集，出 现白色的沉淀线，从而判定相应的抗体和抗原。 • 双向单扩散（simple diffusion in two dimension） • 双向双扩散（double diffusion in two dimension）

NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY双向单扩散含有抗体的琼脂凝胶板沉淀环双向双扩散L水AgarmatrixPrecipitate

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 双向单扩散 双向双扩散

NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原孔的沉淀线互相融合时判为阳性；不出现沉淀线者判为阴性。已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。A'A

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边 已知抗原孔的沉淀线互相融合时判为阳性；不出现沉淀线者 判为阴性。 已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向 被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性

NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原和阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广标准琼扩抗原待检抗原

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原 和阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时， 将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免 疫血清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而 应用范围较广。 标准琼扩抗原 待检抗原

二、实验目的NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY·掌握双向琼脂扩散实验的原理和用途·掌握双向琼脂扩散实验操作方法·观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY • 掌握双向琼脂扩散实验的原理和用途 • 掌握双向琼脂扩散实验操作方法 • 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线 二、实验目的

三、实验材料NANJING AGRICULTURALUNIVERSITY·琼扩抗原·琼扩阳性血清·1%琼脂·湿盒·玻片、打孔器、加样器、tip头等

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY • 琼扩抗原 • 琼扩阳性血清 • 1%琼脂 • 湿盒 • 玻片、打孔器、加样器、tip头等 三、实验材料

四、实验步骤NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY1.称取1g琼脂粉，加至100ml生理盐水(0.9%NaC1溶液）中，配制1%琼脂凝胶；2．稍冷至55℃却后浇板（4ml/块），2-3mm厚的凝胶块；3.．待凝固后在琼脂上打梅花孔（孔径2mm，孔距3mm），孔内的琼脂如未吸出则用注射器针头挑出；4.封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻片紧贴;

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 四、实验步骤 1. 称取1g琼脂粉，加至100ml 生理盐水(0.9% NaCl溶液) 中，配制1%琼脂凝胶； 2. 稍冷至55 ℃却后浇板(4ml/块)，2-3mm厚的凝胶块 ； 3. 待凝固后在琼脂上打梅花孔(孔径2mm,孔距3mm)，孔内 的琼脂如未吸出则用注射器针头挑出； 4. 封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻片紧 贴；

NANJING AGRICULTURALUNIVERSITY5.将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16，6．中间孔加抗原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个孔加滴入生理盐水作为阴性对照；7.置37℃湿盒24-48h；8．结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀，以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。Ag原液PBS01:21:161:41:8

NANJING AGRICULTURAL UNIVERSITY 5. 将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16， 6. 中间孔加抗原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个 孔加滴入生理盐水作为阴性对照； 7. 置37 ℃湿盒24-48h； 8. 结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀， 以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。 扩散 原液 1:2 1:4 1:8 1:16 Ag Ab PBS