甘肃农业大学：《分子生物学》课程教学资源（课件讲稿）第十四章 分子生物学技术

第十四章分子生物学技术 第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法

第十四章 分子生物学技术 第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法 1

分子生物学技术 70年代以来，分子生物学技术迅速发展起 来，使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究，分析其功能特征，了解 其变化规律。分子生物学技术为揭示人 类遗传病的本质起着重要作用。下面就 些分子生物学技术予以介绍。 2

分子生物学技术  70年代以来,分子生物学技术迅速发展起 来,使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究,分析其功能特征,了解 其变化规律。分子生物学技术为揭示人 类遗传病的本质起着重要作用。下面就 一些分子生物学技术予以介绍。 2

1996酵母基因组序列 1956HbsGlu-Va 1972重组质粒 1944DNA是遗传物质 1986位置克隆 第一个R酶 1983HD病G定位 1946 1950 19551960>1965(1970197519809851990- 1995 1949Hbs贫血 1953双螺旋 1966遗传密码 1975DNA杂交 现代分子遗传学发展 1977DNA测序 1981转G小鼠 重要事件 1985PCR 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列

3 1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质 1949Hbs贫血 1953双螺旋 1956HbsGlu-Val 1966遗传密码 第一个R酶 1972重组质粒 1975DNA杂交 1977DNA测序 1981转G小鼠 1983HD病G定位 1985PCR 1986位置克隆 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列 1996酵母基因组序列 现代分子遗传学发展 重要事件

第一节重组DNA技术-基因工程 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Eng ineer ing)的核心技术。 重组DNA技术(Recombinant DNA Technique) 是人类根据需要选择目的基因(DNA片段) 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用

第一节 重组DNA技术-基因工程  重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。  重组DNA技术（Recombinant DNA Technique） 是人类根据需要选择目的基因（DNA片段） 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的。  这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。 4

限制酶 限制性内切核酸酶(restr ictive endonuc leases)，又称限制。是特异性地 切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手 术刀”) 发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶

一、限制酶  限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地 切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手 术刀”）。  发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 5

1、限制酶的命名 ●根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E coRI 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coIi的RY13菌株，I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。 6

1、限制酶的命名  根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号  EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。 6

2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸 序列，称为限制性位点或切点。 如：Hare川5-GGCC-3 Bam HI 5'-GGATCC-3 平未端(blunt end)对称轴切，连接效果差 切割形成粘性末端(sticky end)交错切

2、限制酶识别序列和切割形成  每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸 序列，称为限制性位点或切点。 如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。 7

Hpa I 5-GHTHT AAHC3 3CAA☒TIG5 CUT Eco RI so AA回可H⊙3 cHTHTHAHAG5 3 CUT Hind Ill A☒AH©H©T3 5" 3 T-T▣aAA5 CUT 5©TsHc-Aa3 3 GAHCHGHTH⊙ CUT Pst I 8

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Restriction site in Enzyme Source organism double-stranded DNA EcoRI Echerichia coli 5" -G-A-A-T-T-C. -C-T-T-A-A-G- 51 m EcoRII E.coli 5· GCeT-G-G-C- -C-G-G-A-C-C-G- 5 部分常用限制酶及切点 m个 Hindil Haemophilus 5 -G-T-Py-Pu-A-C- influenzae -C-A-Pu-Py-T-G- ↑ Findl H.infuenzae 5 -A-A-G-C-T-T- -T-T-C-G-A-A- 5 个m Haelll FI.aegyptius 5 O-G-C-C- ---雪 54 Hpell H.parainfluenzae C-C-G-G- G-G-C-C 5 Pstl Providencia 5 -C-T-G-C-A-G- stuartii -G-A-C-G-T-C-5 Smal Serratia 5'-c-C-C-G-G-G- a产CSCe2国 G-G-Gi-●--●-5 Barl Bacilfus 5, -G-G-A.T-C-C. amnylollquefactens -C-C-T-A-G-G5 Bgill B.globiggi A-G-A-TCT 51 9

部分常用限制酶及切点 9

互补末端连接 AATT工 35 3 TTAA工 3 annealing AATT 3 工 TT AA AAT工 ATAT 十 3 ■工 10

互补末端连接 10