延安大学：《医学微生物学与免疫学》精品课程实验指导教学_免疫学——酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合反应（Complement fixation Test, CFT）

实验三 1.酶联免疫吸附试验(EL|SA 2补体结合反应

实验三 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 2.补体结合反应

1.酶联免疫吸附试验(EL|SA

1.酶联免疫吸附试验（ELISA)

免疫标记技术 1.定义 将抗原抗体反应与标记技术相结合,用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原,通 过检测标记物,间接测定未知的抗原或抗体。 2.分类: √放射免疫测定法:131,32P 免疫荧光技术:FITG,PE √免疫酶测定法:HRP,AP

免疫标记技术 1.定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射 性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 2.分类： ✓ 放射免疫测定法：131I， 32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP

免疫酶测定法 (Enzyme I munoaSsay, ElA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶GHRP),碱性磷酸酶(AP) 特点: √高度特异性:保持抗原抗体反应的特异性 √高灵敏度:酶催化底物显色的高效性,pg水平微量检测 定性定量检测:反应液颜色深浅或光密度值 分类: √酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法:组织中或细胞表面的抗原

免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA) • 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 – 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) • 特点： ✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 • 分类： ✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) 1.定义用酶标记抗原或抗体检测液体(血液、细胞液) 中未知抗体或抗原的方法。 2分类>间接法( Indirect el|sA): 将已知抗原吸附于固相载体,酶标记二抗 检测液相中未知抗体 >双抗体夹心法( SandwichEs) 将已知抗体吸附于固相载体,酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 >竞争法( Competitive ELISA): 将已知抗体或抗原吸附于固相载体,酶标记抗原 或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 ➢ 间接法（Indirect ELISA）： • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体 ➢ 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： • 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原 ➢ 竞争法（Competitive ELISA) ： • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原 或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) 3.原理(以间接性ELsA为例): 抗原 待测抗体 洗涤 人一洗涤 人, 酶标二抗 底物 *洗涤 + substrate 米1 显色 八人

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3. 原理（以间接性ELISA为例）： 显色

实验内容 间接法测定溶血素—定性检测

实验内容： 间接法测定溶血素 ——定性检测

实验材料 √脱纤维绵羊红细胞—抗原 √兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素)一待测兔血清 HRP标记羊抗兔lgG一二抗 √包被缓冲液ε0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液 √洗涤液:含0.05%Twen20的0.01MpH7.4PBS 底物缓冲液:pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 √底物溶液:0PD10mg,底物缓冲液25m,30%H2O240μL √酶标板,酶标仪

实验材料 ✓ 脱纤维绵羊红细胞—— 抗原 ✓ 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）—— 待测兔血清 ✓ HRP标记羊抗兔IgG —— 二抗 ✓ 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 ✓ 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS ✓ 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 ✓ 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40μL ✓ 酶标板，酶标仪

实验方法 脱纤维绵羊血 加3mLN.S,混匀 v 2000rpm, 5min 1.抗原的处理: 加3mLN.S,混匀 ↓2000pm,5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水,震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1:400备用 2.包被抗原: 取酶标板,加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃,湿盒内,18h

实验方法 1.抗原的处理： 脱纤维绵羊血 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1：400备用 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，湿盒内，18h

实验方法 取出包被好抗原的酶标板(4孔/组),甩干孔内液体 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次 3.加待测血清标记各孔,加入相应液体100u孔 1234 空阴阳待 37℃,湿盒内,30min 白性性测 甩干孔内液体 4.加二抗: 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min次 各孔加入酶标二抗100μL孔 37℃,湿盒内,30mi 甩干孔内液体 5.显色: 以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3mn/次 加入底物溶液100μL/孔 6.观察结果 避光显色,10min

取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴 性 空 白 阳 性 待 测 4.加二抗： 37℃，湿盒内，30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，湿盒内，30min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色，10min 6.观察结果 实验方法