广东海洋大学：《兽医内科学》课程实验指导（讲义）实验四 血液丙酮酸的测定

实验四血液丙酮酸的测定一、原理血液中的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯腺，后者可用有机溶剂抽提分离。但丙酮、乙酰乙酸及抗坏血酸等含有羰基的化合物，皆能形成类似的苯，故需再用碳酸钠溶液抽提，将丙酮酸苯从其它苯类及剩余的苯肼中分离出来，苯粽在强碱性溶液中生成红色物质，再与同样处理的标准液比色，可求得血液中丙酮酸的含量。丙酮酸和2,4-二硝基苯肼的反应式如下：NO2BLCH3NO2HN-NH--NO-H-NT--N0.H.CCoOHCOOH丙酮酸2，4一二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腺二、试剂1.2mol/LNaOH 溶液。2.10%三氯醋酸溶液(应新鲜配制，并保存于冰箱中)。3.0.1%2,4一二硝基苯肼溶液取2，4一二硝基苯肼100mg，溶于2mol/LHCI溶液中使成100mL(如溶解不完全，可放在56℃水浴中加温助溶)，盛于棕色瓶中，置冰箱保存。4.一甲苯。5.10%无水碳酸钠溶液

实验四 血液丙酮酸的测定 一、原理 血液中的丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯 腙，后者可用有机溶剂抽提分离。但丙酮、乙酰乙酸及抗坏血酸等含 有羰基的化合物，皆能形成类似的苯腙，故需再用碳酸钠溶液抽提， 将丙酮酸苯腙从其它苯腙类及剩余的苯肼中分离出来，苯腙在强碱性 溶液中生成红色物质，再与同样处理的标准液比色，可求得血液中丙 酮酸的含量。丙酮酸和 2,4-二硝基苯肼的反应式如下： 二、试 剂 1.2mol/LNaOH 溶液。 2.10%三氯醋酸溶液(应新鲜配制，并保存于冰箱中)。 3.0.1% 2,4 一二硝基苯肼溶液 取 2，4 一二硝基苯肼 100mg，溶于 2mol/L HCl 溶液中使成 100mL(如溶解不完全，可放在 56℃水浴中 加温助溶)，盛于棕色瓶中，置冰箱保存。 4.一甲苯。 5.10%无水碳酸钠溶液

6.丙酮酸标准贮存液(1mg/mL）精确称取丙酮酸钠(AR)25mg，置于100mL容量瓶中，用0.05mL(0.1N)硫酸溶解并稀释至刻度。于冰箱中约可保存一月。7.丙酮酸标准应用液(0.01mg/mL）吸取丙酮酸标准贮存液1mL，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。三、操作1.无蛋白血滤液的制备。取抗凝血1份，加入预冷的10%三氯醋酸液4份，边加边摇，充分混匀。放置10min，4000转/分离心6min，上清液倒入另一管中备用。表6-4丙酮酸测定操作步骤（单位：mL）试剂空白管测定管标准管无蛋白血滤液（1：5)3.0--蒸馏水0.6一一0.6丙酮酸应用液一2. 410%三氯醋酸液2.4一1.01.01.02,4-二硝基苯肼液混合后，放置37℃水浴中5min，取出加甲苯4mL，甩橡皮球接吸管通气2分钟，静置待分层后将甲苯层吸出，置于另一试管内；余下的液体再加甲苯2m1，如上述方法重复提取两次，提取液与第一次的合并在一起备用

6.丙酮酸标准贮存液(1mg/mL) 精确称取丙酮酸钠(AR)l25mg，置于 100mL 容量瓶中，用 0.05mL(0.1N)硫酸溶解并稀释至刻度。于冰箱 中约可保存一月。 7. 丙酮酸标准应用液(0.01mg/mL) 吸取丙酮酸标准贮存液 1mL，置 于 100mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。 三、操作 1.无蛋白血滤液的制备。 取抗凝血 1 份，加入预冷的 10%三氯醋酸液 4 份，边加边摇，充 分混匀。放置 10min，4000 转/分离心 6min，上清液倒入另一管中 备用。 混合后，放置 37℃水浴中 5min，取出加甲苯 4mL，甩橡皮球接吸 管通气 2 分钟，静置待分 层后将甲苯层吸出，置于另一试管内；余 下的液体再加甲苯 2m1，如上述方法重复提取两次，提取液与第一 次的合并在一起备用

10%无水碳酸钠溶液（加在甲苯提取液试4.04.04.0管中）混匀静置，待分层后取下层碳酸钠液3.0mL于另一试管中2mo1/L氢氧化钠液2.02.02.0混合，10分钟后用波长520m进行比色，以空自管校正“0”点，读取各管光密度。四、计算丙酮酸（mg/100mL）=测定管光密度/标准管光密度x0.006×100-0.6丙酮酸(mmol/L)=丙酮酸（mg/100mL）×0.1136五、正常参考值奶牛：0.57(0.34~0.76)mg/100mL六、临床意义丙酮酸为糖代谢的中间产物，当维生索B1缺乏时，丙酮酸氧化脱羧酶的合成减少，致其氧化脱羧发生障碍，导致丙酮酸堆积，从而使其含量升高，故可作为维生素B1缺乏症的诊断指标。但当机体缺氧时(如马麻痹性肌红蛋白尿病)及肝脏受损时(如奶牛酮病的严重阶段)糖的代谢也会发生障碍而致其含量升高。七、注意事项血液中的丙酮酸极不稳定，采血时应以碘乙酸钠作抗凝剂，并在30min内制成血滤液，以保

四、计算 丙酮酸（mg/100mL） =测定管光密度/标准管光密度 ×0.006×100÷0.6 丙酮酸(mmol/L)=丙酮酸（mg/100mL）×0.1136 五、正常参考值 奶牛：0.57(0.34～0.76) mg/100mL 六、临床意义 丙酮酸为糖代谢的中间产物，当维生索 B1 缺乏时，丙酮酸氧 化脱羧酶的合成减少，致其氧化脱羧发生障碍，导致丙酮酸堆积，从 而使其含量升高，故可作为维生素 B1 缺乏症的诊断指标。但当机 体缺氧时(如马麻痹性肌红蛋白尿病)及肝脏受损时(如奶牛酮病的严 重阶段)糖的代谢也会发生障碍而致其含量升高。 七、注意事项 血液中的丙酮酸极不稳定，采血时应以碘乙酸钠作抗凝剂，并在 30min 内制成血滤液，以保