广东海洋大学：《兽医内科学》课程实验指导（讲义）实验一 血清总钙含量的测定

实验一 血清总钙含量的测定(一)邻-甲酚酞络合酮比色法1.原理邻-甲酚酞络合酮是金属络合指示剂，也是酸碱指示剂，在碱性溶液中与钙及镁聚合，生成紫红色螯合物。作钙测定时，在试剂中加人8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰。2.器材与试剂(1)邻-甲酚酞络合酮显色剂称取8-羟基喹啉500mg，置烧杯中，加浓盐酸5mL，使其溶解并转入50mL容量瓶中，再加入邻-甲酚酞络合酮25mg，待完全溶解后，加Tri-tonX-1001mL，混匀，然后加去离子水至刻度，置聚乙烯瓶内保存(2)1mol/LAMP碱性缓冲液称取2-氨基-2-甲基-1-丙醇89.14g，置1L容量瓶中，加500mL去离子水溶解，待完全溶解后加至刻度，置聚乙烯瓶中室温保存。(3)显色应用液应用时，根据当日标本的多少将上述两液等量混合。(4)钙标准液(2.5mmol/L）精确称取经110℃干燥12h的碳酸钙250mg，置于1L容量瓶内，加稀盐酸1份浓盐酸加9份去离子水)7mL溶解后，加去离子水约900mL，然后用500g/L醋酸铵溶液调pH至7.0，最后加去离子水至刻度，混匀。3.操作方法取试管3支，注明测定、标准和空白管，在测定管中加入血清0.05mL，在标准管中加入钙标准液0.05mL，空白管中加去离子水0.05mL，上述各管加显色应用液4mL，混匀，放5min后，分光光度计波长575nm，10mm光径比色杯用空白管调零，读取各管吸光度。如标本混浊、黄疽或溶血，需作校正试验，于空白管及测定管中各加入5g/LEGTA溶液0.05mL，再测吸光度，两次读取的吸光度差，即为校正吸光度。4.计算血清钙(mmol/L)=测定管吸光度（或校正吸光度）/标准管吸光度×2.5

实验一 血清总钙含量的测定 (一)邻-甲酚酞络合酮比色法 1.原理 邻-甲酚酞络合酮是金属络合指示剂，也是酸碱指示剂，在碱 性溶液中与钙及镁聚合，生成紫红色螯合物。作钙测定时，在试剂中 加人 8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰。 2.器材与试剂 (1)邻-甲酚酞络合酮显色剂 称取 8-羟基喹啉 500mg，置烧杯中，加 浓盐酸 5mL，使其溶解并转入 50mL 容量瓶中，再加入邻-甲酚酞络 合酮 25mg，待完全溶解后，加 Tri-ton X-100 1mL，混匀，然后加去 离子水至刻度，置聚乙烯瓶内保存。 (2)1mol/L AMP 碱性缓冲液 称取 2-氨基-2-甲基-1-丙醇 89.14g，置 1L 容量瓶中，加 500mL 去离子水溶解，待完全溶解后加至刻度，置 聚乙烯瓶中室温保存。 (3)显色应用液 应用时，根据当日标本的多少将上述两液等量混合。 (4)钙标准液(2.5mmol/L) 精确称取经 110℃干燥 12h 的碳酸钙 250mg，置于 1L 容量瓶内，加稀盐酸(1 份浓盐酸加 9 份去离子 水)7mL 溶解后，加去离子水约 900mL，然后用 500g/L 醋酸铵 溶液调 pH 至 7.0，最后加去离子水至刻度，混匀。 3.操作方法 取试管 3 支，注明测定、标准和空白管，在测定管中加 入血清 0.05mL，在标准 管中加入钙标准液 0.05mL，空白管中加去 离子水 0.05mL，上述各管加显色应用液 4mL，混匀，放 5min 后， 分光光度计波长 575nm，10mm 光径比色杯用空白管调零，读取各 管吸光度。 如标本混浊、黄疸或溶血，需作校正试验，于空白管及 测定管中各加入 5g/L EGTA 溶液 0.05mL，再测吸光度，两次读取 的吸光度差，即为校正吸光度。 4.计算 血清钙(mmol/L)=测定管吸光度（或校正吸光度）/标准管吸光度×2.5

血清钙(mg/dL)=血清钙(mmol/L)-0.255.注意事项(1)用血清或肝素抗凝血浆作标本,不能用钙螯合剂(EDTANa2)及草酸盐作抗凝剂。(2)邻-甲酚络合酮试剂灵敏度很高，所用的试管和器血如有微量的钙污染亦会起测定误差，故此测定最好用1次性使用的塑料管，所有试剂应在聚乙烯瓶内保存。如果条件不允许而用玻璃试管和器皿时，一定要经稀盐酸泡洗，再用去离子水冲净后方可使用。(3)用来作血清钙测定的碱性缓冲液较多，可根据条件选用。常用的有乙二胺-氰化钾、乙二胺-醋酸钾-盐酸、乙二胺-乙二醇、乙醇胺-硼酸、2-氨基-2-甲基-1-丙醇等。用乙二胺-乙二醇缓冲液测定较稳定。乙醇胺-硼酸缓冲液缓冲容量较大，并能使空白试剂的吸光度保持较低读数。2-氨基-2-甲基-1-丙醇无毒、无刺激性，也能使空白管有较低的读数。若试剂吸光度较高时，则标准曲线不通过零点，产生负截距。遇此情况，可在试剂中加入适量的EDTA·Na2(注意：试剂应呈淡紫色，不可无色）或用1.25、2.5mmol/L标准液作二点定标。(二)甲基麝香草酚蓝比色法1.原理血清中钙离子在碱性溶液中与甲基麝香草酚蓝结合，生成蓝色的络合物。加入适当的8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，以求得血清总钙的含量。2.器材与试剂(1)甲基麝香草酚蓝贮存液称取8-羟基喹啉4.0g于50mL去离子水中，再加浓硫酸5mL，搅拌促使其溶解，移入1L容量瓶中，加甲基麝香草酚蓝0.2g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)6.0g，最后用蒸馏水稀释至刻度，贮存于棕色瓶中，置冰箱保存

血清钙(mg/dL)=血清钙(mmol/L)÷0.25 5.注意事项 (1)用血清或肝素抗凝血浆作标本，不能用钙螯合剂(EDTANa2)及草酸 盐作抗凝剂。 (2)邻-甲酚酞络合酮试剂灵敏度很高，所用的试管和器皿如有微量的 钙污染亦会起测定误差，故此测定最好用 1 次性使用的塑料管，所 有试剂应在聚乙烯瓶内保存。如果条件不允许而用玻璃试管和器皿 时，一定要经稀盐酸泡洗，再用去离子水冲净后方可使用。 (3)用来作血清钙测定的碱性缓冲液较多，可根据条件选用。常用的 有乙二胺-氰化钾、乙二胺-醋酸钾-盐酸、乙二胺-乙二醇、乙醇胺-硼 酸、2-氨基-2-甲基-1-丙醇等。用乙二胺-乙二醇缓冲液测定较稳定。 乙醇胺-硼酸缓冲液缓冲容量较大，并能使空白试剂的吸光度保持较 低读数。2-氨基-2-甲基-1-丙醇无毒、无刺激性，也能使空白管有较 低的读数。 若试剂吸光度较高时，则标准曲线不通过零点，产生负 截距。遇此情况，可在试剂中加入适量的 EDTA·Na2(注意：试剂应 呈淡紫色，不可无色)或用 1.25、2.5mmol/L 标准液作二点定标。 (二)甲基麝香草酚蓝比色法 1.原理 血清中钙离子在碱性溶液中与甲基麝香草酚蓝结合，生成蓝 色的络合物。加入适当的 8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰， 与同样处理的钙标准液进行比较，以求得血清总钙的含量。 2.器材与试剂 (1)甲基麝香草酚蓝贮存液 称取 8-羟基喹啉 4.0g 于 50mL 去离子 水中，再加浓硫酸 5mL，搅拌促使其溶解，移入 1L 容量瓶中，加 甲基麝香草酚蓝 0.2g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)6.0g，最后用蒸馏水稀 释至刻度，贮存于棕色瓶中，置冰箱保存

(2)碱性溶液取二乙胺溶液35mL于1L容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，室温保存。(3)显色应用液临用前，根据标本量取(1)液1份与(2)液3份混合即可。(4)钙标准液(2.5mmol/L）配制方法同上法。3.操作方法按表1步骤进行。表1血清钙测定操作步骤空白管加入物测定管标准管50血清(μL)/1/50钙标准液(μL)1/150去离子水(μL)4.0显色应用液（mL）4.04.0将各管混匀，10min后，分光光度计用610nm波长，10mm光径比色杯，以空白管调零，进行比色，读取各管吸光度。4.计算血清钙（mmol/L）=测定管吸光度/标准管吸光度×2.5(三)乙二胺四乙酸二钠滴定法1.原理血清钙离子在碱性溶液中与钙红指示剂结合，成为可溶性的复合物，使溶液呈淡红色。乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)对钙离子有更大的亲和力，能与复合物中的钙离子络合，使钙红指示剂重新游离，溶液变成蓝色。从 EDTANa2 滴定用量可以计算出血清钙的含量。2. 试剂(1)钙标准液(2.5mmol/L)同上法。(2)钙红指示剂称取钙红(Cal-Red 或 Calcon，2-萘酚-4-磺酸-1-偶氮-2-羟基-3-苯甲酸钠盐)0.1g，溶于甲醇20mL中，置棕色瓶中保存

(2)碱性溶液 取二乙胺溶液 35mL 于 1L 容量瓶中，用去离子水稀 释至刻度，室温保存。 (3)显色应用液 临用前，根据标本量取(1)液 1 份与(2)液 3 份混合即 可。 (4)钙标准液(2.5mmol/L) 配制方法同上法。 3.操作方法 按表 1 步骤进行。 表 1 血清钙测定操作步骤 加入物 测定管 标准管 空白管 血清(μL) 50 / / 钙标准液(μL) / 50 / 去离子水(μL) / / 50 显色应用液（mL） 4.0 4.0 4.0 将各管混匀，10min 后，分光光度计用 610nm 波长，10mm 光径比 色杯，以空白管调零，进行比色，读取各管吸光度。 4.计算 血清钙（mmol/L）=测定管吸光度/标准管吸光度×2.5 (三)乙二胺四乙酸二钠滴定法 1.原理 血清钙离子在碱性溶液中与钙红指示剂结合，成为可溶性的 复合物，使溶液呈淡红色。乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)对钙离子有 更大的亲和力，能与复合物中的钙离子络合，使钙红指示剂重新游离， 溶液变成蓝色。从 EDTA Na2 滴定用量可以计算出血清钙的含量。 2.试剂 (1)钙标准液(2.5mmol/L) 同上法。 (2)钙红指示剂 称取钙红(Cal-Red 或 Calcon，2-萘酚-4-磺酸-1-偶氮 -2-羟基-3-苯甲酸钠盐)0.1g，溶于甲醇 20mL 中，置棕色瓶中保存

(3)0.25mol/L氢氧化钾溶液。(4)EDTANa2溶液溶解EDTANa2400mg于500mL去离子水中溶解后再补足至1000mL。3.操作方法(1)取试管2支，写明测定管和标准管，于测定管中加入血清0.2mL，标准管中加钙标准液0.2mL。(2)各管加人0.25mol/L氢氧化钾溶液2mL，钙红指示剂2滴，混匀，溶液呈淡红色。(3)迅速以EDTANa2滴定至溶液呈淡蓝色为终点，记录各管EDTANa2用量。4.计算血清钙mmol/L=测定管EDTANa 消耗量(mL)/标准管EDTANa2消耗量（mL）×0.25血清钙(mg/d1)=血清钙(mmol/L)-0.255.注意事项(1)标本加碱后应及时滴定，时间过长会推迟终点出现。(2)测定标本若有黄疽或溶血时，终点不易判断，则必须将标本进行处理，首先用草酸盐将钙沉淀，再用盐酸及枸橡酸钠重溶，除上述试剂外，尚需要增加以下试剂：0.7mol/L草酸铵；0.05mol/L枸橡酸钠；lmol/L盐酸。并按下列步骤操作：①吸取血清0.2mL，置于离心管中，加去离子水0.25mL，0.7mol/L草酸铵0.05mL，混匀。②置56℃水浴中15min。③2000r/min离心10min。④小心倾去上清液，并将离心管倒立于滤纸上沥干。3③加1mol/L盐酸及0.05mol/L枸橡酸钠各0.1mL于离心管中，溶解沉淀

(3)0.25mol/L 氢氧化钾溶液。 (4)EDTANa2 溶液 溶解 EDTA Na2 400mg 于 500mL 去离子水中， 溶解后再补足至 1000mL。 3.操作方法 (1)取试管 2 支，写明测定管和标准管，于测定管中加入血清 0.2mL， 标准管中加钙标准液 0.2mL。 (2)各管加人 0.25mol/L 氢氧化钾溶液 2mL，钙红指示剂 2 滴，混 匀，溶液呈淡红色。 (3)迅速以 EDTA Na2 滴定至溶液呈淡蓝色为终点，记录各管 EDTA Na2 用量。 4.计算 血清钙 mmol/L= 测定管 EDTA Na 消耗量（mL）/标准管 EDTA Na2 消耗量（mL）×0.25 血清钙(mg/d1)=血清钙(mmol/L)÷0.25 5.注意事项 (1)标本加碱后应及时滴定，时间过长会推迟终点出现。 (2)测定标本若有黄疸或溶血时，终点不易判断，则必须将标本进行 处理，首先用草酸盐将钙沉淀，再用盐酸及枸橼酸钠重溶，除上述试 剂外，尚需要增加以下试剂：0.7mol/L 草酸铵；0.05mol/L 枸橼酸钠； lmol/L 盐酸。并按下列步骤操作： ①吸取血清 0.2mL，置于离心管中，加去离子水 0.25mL，0.7mol/L 草 酸铵 0.05mL，混匀。 ②置 56℃水浴中 15min。 ③2 000r/min 离心 l0min。 ④小心倾去上清液，并将离心管倒立于滤纸上沥干。3 ⑤加 1mol/L 盐酸及 0.05mol/L 枸橼酸钠各 0.1mL 于离心管中，溶 解沉淀

③按上述血清直接滴定法进行滴定及计算(同时滴定一份标准管)。二、血清离子钙的测定()原理离子选择电极是一种化学传感器，它能将溶液中某种特定离子的活度转变成电位信号，然后通过仪器来测量。电极电位随溶液中离子活度变化的关系服从Nernst方程。选择电极的电位(E)与溶液中被测离子活度的对数成线性关系。血液抽出后，溶解于其中的CO2气体会释放到空气中，使血液pH变碱性，而血液pH则与离子钙浓度之间成负相关的关系，pH增加0.1，离子钙浓度约降低4%~5%。所以新型的离子钙分析仪都是在测定血清离子钙浓度的同时，测量血清 pH，再计算出pH7.4时的标准化离子钙(nCa2+)浓度。离子钙分析仪通常采用比较法来测定样品溶液中离子钙和pH，即先测量二个已知浓度准液中的离子钙和pH的电极电位，在仪器程序内建立一条斜率曲线，然后测量样品溶液中离子钙和pH的电极电位，从已建立的斜率曲线上求出样品溶液中离子钙浓度和 pH，并计算出标准化离子钙浓度，直接在仪器上显示出结果或打印出分析报告。(二)器材与试剂各厂家生产的仪器所需试剂都是配套供应的，其配方未完全公开。(三)操作方法商品的离子钙分析仪所用的钙电极都采用中性载体作钙电极的活性材料制成聚氯乙烯(PVC)电极膜，电极的寿命约半年左右；pH电极由特殊玻璃毛细管制成；参考电极采用银/氯化银制成。各种型号的离子钙分析仪的试剂配方、试剂用量、操作方法有所不同，一般要进行下列步骤。本法以一种国产的离子钙分析仪为例。1.接上电源，仪器首先进行显示及电子线路检测，结束后即可进行二点斜率定标

⑥按上述血清直接滴定法进行滴定及计算(同时滴定一份标准管)。 二、血清离子钙的测定 ㈠原理 离子选择电极是一种化学传感器，它能将溶液中某种特定离 子的活度转变成电位信号，然后通过仪器来测量。电极电位随溶液中 离子活度变化的关系服从 Nernst 方程。选择电极的电位(E)与溶液中 被测离子活度的对数成线性关系。血液抽出后，溶解于其中的 C02 气体会释放到空气中，使血液 pH 变碱性，而血液 pH 则与离子钙 浓度之间成负相关的关系，pH 增加 0.1，离子钙浓度约降低 4%～ 5%。所以新型的离子钙分析仪都是在测定血清离子钙浓度的同时， 测量血清 pH，再计算出 pH7.4 时的标准化离子钙(nCa2+)浓度。离 子钙分析仪通常采用比较法来测定样品溶液中离子钙和 pH，即先测 量二个已知浓度准液中的离子钙和 pH 的电极电位，在仪器程序内 建立一条斜率曲线，然后测量样品溶液中离子钙和 pH 的电极电位， 从已建立的斜率曲线上求出样品溶液中离子钙浓度和 pH，并计算出 标准化离子钙浓度，直接在仪器上显示出结果或打印出分析报告。 (二)器材与试剂 各厂家生产的仪器所需试剂都是配套供应的，其配 方未完全公开。 (三)操作方法 商品的离子钙分析仪所用的钙电极都采用中性载体作 钙电极的活性材料制成聚氯乙烯(PVC)电极膜，电极的寿命约半年左 右；pH 电极由特殊玻璃毛细管制成；参考电极采用银/氯化银制成。 各种型号的离子钙分析仪的试剂配方、试剂用量、操作方法有所不同， 一般要进行下列步骤。本法以一种国产的离子钙分析仪为例。 l.接上电源，仪器首先进行显示及电子线路检测，结束后即可进行二 点斜率定标

2.斜率定标时，推出吸样针先后将其浸入盛有低、高二个浓度斜率定标仪的小瓶中，吸取斜率定标液，待仪器发出“嘟"声后移去，吸样针推回原处，仪器自动进行斜率定标。3.定标通过后，可进行样品测量。(1)毛细管血测量将毛细管血混匀，推出吸样针，取掉两端塞子，1头装上接头，将接头另一端装在取样针上，按“测量”键直到样品完全充满样品测量腔后，再松开“测量"键，进样泵即停止工作。此时应检查样品测量腔内的样品是否有气泡，如有气泡存在，应在松开“测量”键8s内，再按“测量键，继续吸取样品，直至排除气泡为止。移去样品，擦净吸样针并推回原位，在进样结束8s后即显示测量数据并打印结果。(2)全血测量将血液样品混匀，推出吸样针，将吸样针浸入血样中，按“测量"仪器自动吸人样品，待仪器发出“嘟”声，移开样品，推回吸样针，8s后仪器即显示测量数据或打印结果。(3)血清测量过程同全血测量。(4)标本测量结束，仪器冲管路和样品测量腔，冲洗好后即可进行下个样品的测定量。(5)在最后1次定标或血样测量结束后10min不操作仪器，仪器将进入“休眠”状态。此时如需进行血样测定，必须先进行一点定标。若没有血样测定，仪器每隔30min自动进行1次一点定标

2.斜率定标时，推出吸样针先后将其浸入盛有低、高二个浓度斜率定 标仪的小瓶中，吸取斜率定标液，待仪器发出“嘟”声后移去，吸样针 推回原处，仪器自动进行斜率定标。 3.定标通过后，可进行样品测量。 (1)毛细管血测量 将毛细管血混匀，推出吸样针，取掉两端塞子，一 头装上接头，将接头另一端装在取样针上，按“测量”键直到样品完全 充满样品测量腔后，再松开“测量”键，进样泵即停止工作。此时应检 查样品测量腔内的样品是否有气泡，如有气泡存在，应在松开“测量” 键 8s 内，再按“测量”键，继续吸取样品，直至排除气泡为止。移去 样品，擦净吸样针并推回原位，在进样结束 8s 后即显示测量数据并 打印结果。 (2)全血测量 将血液样品混匀，推出吸样针，将吸样针浸入血样中， 按“测量”仪器自动吸人样品，待仪器发出“嘟”声，移开样品，推回吸 样针，8s 后仪器即显示测量数据或打印结果。 (3)血清测量过程同全血测量。 (4)标本测量结束，仪器冲管路和样品测量腔，冲洗好后即可进行下 一个样品的测定量。 (5)在最后 1 次定标或血样测量结束后 10min 不操作仪器，仪器将 进入“休眠”状态。此时如需进行血样测定，必须先进行一点定标。若 没有血样测定，仪器每隔 30min 自动进行 1 次一点定标