复旦大学：《细胞生物学实验 Experiments of Cell Biology》课程教学资源（讲义）叶绿体的分离、纯化和鉴定

叶绿体的分离、纯化和鉴定

叶绿体的分离、纯化和鉴定

背景与原理 细胞器分离、纯化在细胞生物学研究中的意义 基智肥强的囊缇粑先窠入势些 与功能的 细胞器分离、纯化的主要方法和原理 根据细胞器的古少形述密管物理特性差 技菜心卷辖组公箱度 >细胞器分离、纯化过程中的主要注意事项 尽可能保持所分离细胞器的生物活性,包括匀 浆缓冲液(渗透压、pH、离子强度等)的选择 温度、时间等

背景与原理 细胞器分离、纯化在细胞生物学研究中的意义 细胞器的形成是真核细胞生命活动功能区域化 的基础，细胞器的分离、纯化是深入研究亚细胞 结构与功能的基础。 细胞器分离、纯化的主要方法和原理 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差 异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用 的技术，主要包括差速离心、和密度梯度离心等 方法。 细胞器分离、纯化过程中的主要注意事项 尽可能保持所分离细胞器的生物活性，包括匀 浆缓冲液（渗透压、pH、离子强度等）的选择、 温度、时间等

梯度介质的选择 1、蔗糖具备足够大的溶解度,以形成所需的密度梯度范围; 低温下黏度高,扩散慢 2、蔗糖不会与样品中的组分发生反应。 3、蔗糖不会引起样品中组分的凝集、变性或失活,没有毒 性。 4、蔗糖浓度大时渗透压不大。 4、蔗糖PH值中性。 5、蔗糖成本低,易获得 R C F 端器小颗粒 大颗粒 混合液 离心开始后 离心结束 时间

梯度介质的选择 1、蔗糖具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围； 低温下黏度高，扩散慢。 2、蔗糖不会与样品中的组分发生反应。 3、蔗糖不会引起样品中组分的凝集、变性或失活，没有毒 性。 4、蔗糖浓度大时渗透压不大。 4、蔗糖PH值中性。 5、蔗糖成本低，易获得

内膜 基质类囊体基粒 基粒类囊体 叶绿体 母系遗传( maternal inheritance) 基质 W 类囊体腔 叶绿体的结构(引自wol,1993) chup1 CX) ThePlantCelVol.15,2805-2815,December2003,www.plantcelorg2003AmericanSocietyofPantBiologists CHLOROPLAST UNUSUAL POSITIONING1 Is Essential for Proper chloroplast Positioning umio Takahashi, b Takeshi Kanegae, Yasuo Niwa, Akeo Kadota, and Masamitsu Wada bA Department of Biology, Faculty of Science, Graduate School of Tokyo Metropolitan University, Hachioji, Tokyo 192-0397, Japan Solution Oriented Research for Science and Technology, Japan Science and Technology Corporation, Kawaguchi, Saitama 3320012, Japan

叶绿体 叶绿体的结构(引自Wolf，1993） 母系遗传（maternal inheritance）

实验目的 掌握叶绿体分离技术 >观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,熟悉荧光显微镜的 使用

实验目的 掌握叶绿体分离技术 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的 使用

实验材料、仪器和试剂 ≯材料:新鲜菠菜 ≯仪器:普通光学显微镜、荧光显微镜、普通离心机、研 钵、剪刀、玻璃皿等 试剂:匀浆介质(0.25mo/蔗糖,0.05 mol/L Tris-HC|缓 冲液ph=74) 50%蔗糖溶液,15%蔗糖溶液,0.01%吖啶橙

实验材料、仪器和试剂 材料：新鲜菠菜 仪器：普通光学显微镜、荧光显微镜、普通离心机、研 钵、剪刀、玻璃皿等 试剂：匀浆介质（0.25mol/L蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl 缓 冲液 ph=7.4） 50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙

实验步骤 1选取菠菜叶片(选择録色的新鲜叶片),洗净擦干后去除 叶梗和粗脉,撕成小碎块(剪碎更宜碾 称2~3g放于玻 璃匀浆器中 2加入预冷(放在冰上)到匀浆介质10m,在冰上用研 钵研磨。 3捣碎液用尼龙网过滤于50m烧杯中。 4将滤液平分到2个离心管中(2m),1000min下离心1min(离 轻轻吸取上清液。 5.在2.oml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9m和15%蔗糖溶液 0.5m 离心营壁注 6.小心地沿离心管壁加入04m上清液。 7.离心8000r/min,20min。 8.取出离心管,可见叶绿体在密度梯度液中间形成带

实验步骤 1.选取菠菜叶片（选择嫩绿色的新鲜叶片），洗净擦干后去除 叶梗和粗脉，撕成小碎块（剪碎更宜碾磨），称2~3g放于玻 璃匀浆器中 2.加入预冷（放在冰上预冷）到0℃匀浆介质10ml，在冰上用研 钵研磨。 3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中（2ml），1000r/min下离心1min(离 心机配平)， 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml（注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入，不能搅动 50%蔗糖液面）。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带

9用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上 加盖片观察 1)在普通光镜下观察 2)在荧光显微镜下观察直接荧光; 3)在荧光显微镜下观察间接荧光(取叶绿体悬液一滴滴 在无荧光载玻片上,再加一滴0.01%的吖啶橙,盖上盖玻片 后用荧光观察) 10.因为温度、光、淬灭剂等原因,请尽快拍照

9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上， 加盖片观察： 1）在普通光镜下观察； 2）在荧光显微镜下观察直接荧光； 3）在荧光显微镜下观察间接荧光（取叶绿体悬液一滴滴 在无荧光载玻片上，再加一滴0.01%的吖啶橙，盖上盖玻片 后用荧光观察） 10.因为温度、光、淬灭剂等原因，请尽快拍照

菠菜叶片切片观察 在普通显微镜下可以看到三种细胞:表皮细胞(边缘呈锯 齿形的鳞片状细胞)、保卫细胞(构成气孔的成对存在的 肾形细胞)、叶肉细胞(为排成栅状的长形和椭圆形细 胞)。 在荧光显微镜下直接观察,叶绿体发出火红色荧光,但其 荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光。吖啶橙染 色后观察比较

菠菜叶片切片观察  在普通显微镜下可以看到三种细胞：表皮细胞（边缘呈锯 齿形的鳞片状细胞）、保卫细胞（构成气孔的成对存在的 肾形细胞）、叶肉细胞（为排成栅状的长形和椭圆形细 胞）。  在荧光显微镜下直接观察，叶绿体发出火红色荧光，但其 荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光。吖啶橙染 色后观察比较

讨论 优化方法 (1)为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破 坏叶绿体,在提取叶绿体前,先将植物材料暗置 过夜。 (2)细胞破碎时,不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2min同样可以达到很好的效果。此 外,过滤时不要用力挤压,以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓,在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来

讨论 优化方法 (1)为防止光合作用形成的淀粉颗粒在离心时破 坏叶绿体，在提取叶绿体前，先将植物材料暗置 过夜。 (2)细胞破碎时，不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外，过滤时不要用力挤压，以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓，在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来