复旦大学：《细胞生物学实验 Experiments of Cell Biology》课程教学资源（讲义）鼠肾细胞的原代培养

鼠肾细胞的原代培养 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 16/04/2019

鼠肾细胞的原代培养 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 16/04/2019

实验目的 1.了解细胞原代培养的基本方法和 操作过程。 2.掌握使用倒置显微镜观察培养 细胞的形态和生长状况。 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

实验目的 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 2 1. 了解细胞原代培养的基本方法和 操作过程。 2. 掌握使用倒置显微镜观察培养 细胞的形态和生长状况。 16/04/2019

背景知识 细胞培养 原代培养 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

背景知识 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 3 细胞培养 原代培养 16/04/2019

背景知识 细胞培养 ●研究对象是活的细胞,可长时期地监控、检测甚至定 量评估其形态、结构和生命活动等;可以人为地严格控 制研究条件,便于研究各种理、化、生物等外界因素对 细胞生长、发育和分化等的影响。研究的内容便于观察、 检测和记录。 ●细胞培养的条件及环境 营养成分 ●无菌环境 ●恒定温度 体 ●PH值 ●细胞培养可分为两类:原代培养,传代培养 9/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

背景知识 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 4 细胞培养 研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定 量评估其形态、结构和生命活动等；可以人为地严格控 制研究条件，便于研究各种理、化、生物等外界因素对 细胞生长、发育和分化等的影响。研究的内容便于观察、 检测和记录。 细胞培养的条件及环境： 营养成分 无菌环境 恒定温度 气体 PH值 细胞培养可分为两类：原代培养，传代培养 9/04/2019

背景知识 原代培养 ●原代培养∶凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经 特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代 培养。 ●组织中都含有一定量的细胞间质(纤维和基质 等),对细胞生长有妨碍作用,用胰蛋白酶和胶原 酶消化能除去细胞间质,使细胞分散,形成悬液 易于从外界吸收养分和排出代谢产物,细胞也可以 在短时间内生长。 ●主要步骤:取材,消化,离心,培养。 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

背景知识 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 5 原代培养 原代培养：凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经 特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代 培养。 组织中都含有一定量的细胞间质（纤维和基质 等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶和胶原 酶消化能除去细胞间质，使细胞分散，形成悬液， 易于从外界吸收养分和排出代谢产物，细胞也可以 在短时间内生长。 主要步骤：取材，消化，离心，培养。 16/04/2019

实验试剂、设备及材料 ●试剂:乙醚(麻醉乳鼠) 75%酒精(消毒) PBS(磷酸缓冲液 1640细胞培养液(需要加入血清和青霉素、链霉素) 025%胰蛋白酶+0.1%胶原酶(使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离 散) 仪器设备:烧杯,酒精棉,纸板,大头针,离心管,吸管,枪头,酒精灯, 培养皿,记号笔 剪刀,眼科镊子 水浴锅,超净台,离心机,培养箱 ●材料:新生乳鼠 9/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 6

实验试剂、设备及材料  试剂：乙醚（麻醉乳鼠） 75%酒精（消毒） PBS（磷酸缓冲液） 1640细胞培养液（需要加入血清和青霉素、链霉素） 0.25%胰蛋白酶+0.1%胶原酶（使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离 散）  仪器设备：烧杯，酒精棉，纸板，大头针，离心管，吸管，枪头，酒精灯， 培养皿，记号笔 剪刀，眼科镊子 水浴锅，超净台，离心机，培养箱  材料：新生乳鼠 9/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 6

支,实验内容 取材 消毒台面一>乙醚麻醉处死小鼠>第一付剪刀“工”字型剪开皮肤→ 第二付剪刀剪开腹膜取全肾(放入15ml离心管)→→PBS洗两次 消化分离 用第三付剪刀(教师提供)在冰上剪碎肾组织,越碎越好 每个离心管中加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%胶原酶)混合 均匀■37℃水浴消化15分钟,每5分钟轻弹数下,使细胞团块 重悬◆将离心管静置桌面上5分钟,使细胞团块自然沉淀 、离心 吸取上清液(含有离散的细胞)至新的离心管中以3000转分离心3分 钟■→弃上清,留沉淀,加入1mL的1640细胞培养液,吹打均匀。 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

实验内容 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 7 一、取材 消毒台面→ 乙醚麻醉处死小鼠→第一付剪刀 “工”字型剪开皮肤→ 第二付剪刀剪开腹膜取全肾（放入1.5ml 离心管） →PBS洗两次 二、消化分离 三、离心 16/04/2019

实验内容 二、消化分离 用第三付剪刀(教师提供)在冰上剪碎肾组织,越碎越好 每个离心管中加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%胶原酶)混合 均匀■37℃水浴消化15分钟,每5分钟轻弹数下,使细胞团块 重悬。将离心管静置桌面上5分钟,使细胞团块自然沉淀。 三、离 吸取上清液(含有离散的细胞)至新的离心管中■以3000转分离心3分 钟■→弃上清,留沉淀,加入1mL的1640细胞培养液,吹打均匀。 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

实验内容 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 8 二、消化分离 三、离心 16/04/2019

实验内容 >四、培养 将一组两人的细胞悬浮液(共2mL)种入35mm的培养皿中聊→轻轻推 动小皿,使细胞液均匀分布于小皿中将细胞置于培养箱中培养 第二天带教老师观察并换液■→第四天同学观察实验结果 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

实验内容 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 9 四、培养 16/04/2019

预期的实验结果 6/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

预期的实验结果 16/04/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 10