复旦大学：《细胞生物学实验 Experiments of Cell Biology》课程教学资源（讲义）相差、暗室野和荧光显微镜的基本使用方法

相差、暗室野和荧光显 微镜的基本使用方法 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 4 相差、暗室野和荧光显 微镜的基本使用方法

+实验目的 1、了解光学显微镜的基本成像原理 2、掌握相差显微镜的原理和基本使用方法 3、了解暗视野显微镜的成像原理和使用方 法 4、学习荧光显微镜的成像原理和基本操作 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 5 实验目的 1、了解光学显微镜的基本成像原理 2、掌握相差显微镜的原理和基本使用方法 3、了解暗视野显微镜的成像原理和使用方 法 4、学习荧光显微镜的成像原理和基本操作

背景知识 microtubules ar envelope Nucleus uclear pore centriole 显微镜的级别划分 vesicle smooth Mitochondrion Microtubule Kinesin Amino acid 1A 1nm 10nm 100nm ur 10um 0.1mm Atomic Molecular Sub-cellular Cellular 电子显微镜 超分辨率显微锦传统的光学显微镜 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 6 www.3dchem.com;wikipediaorg/wiki/kinesin;cvcweb.icesutexas.edu;Fotinetal.,Nature2004;hrsbstaff.ednet.ns.ca;www.ebi.ac.uk

背景知识 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 6 显微镜的级别划分 Atomic Molecular Sub-cellular Cellular www.3dchem.com; wikipedia.org/wiki/Kinesin; cvcweb.ices.utexas.edu; Fotin et al., Nature 2004; hrsbstaff.ednet.ns.ca; www.ebi.ac.uk 1Å 1nm 10nm 100nm 1µm 10µm 0.1mm 1Å 1nm 10nm 100nm 1µm 10µm 0.1mm 1Å 1nm 10nm 100nm 1m 10m 0.1mm Amino Acid Microtubule Mitochondrion Kinesin 电子显微镜 超分辨率显微镜 传统的光学显微镜

口相差显微镜 Phase Contrast Light Pathways 时问 Condense ↑叛帽 时问 初始光束 出射波 干涉光 n≥n(n.m:屈折率) 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 77

5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 7 相差显微镜 7

」暗视野显微镜 dark field microscope 根据丁达尔效应原理设计的一种在 黑色背景条件下观察被检物体的显 Objective lens 微镜。 ◆聚光镜中央有挡光片,照明光线不 直接进入物镜,只允许被标本反射 Condenser 和衍射的光线进入物镜,因而视野 背景是黑的,物体边缘是亮的。 Dark-field stop ◆可观察4~200nm的微粒子,分辨率 比普通显微镜高50倍。 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 8 暗视野显微镜 dark field microscope  根据丁达尔效应原理设计的一种在 黑色背景条件下观察被检物体的显 微镜。  聚光镜中央有挡光片，照明光线不 直接进入物镜，只允许被标本反射 和衍射的光线进入物镜，因而视野 背景是黑的，物体边缘是亮的。  可观察 4~200nm的微粒子，分辨率 比普通显微镜高50倍

荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点 暗背景、强反差 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 9 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点： 暗背景、强反差

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5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 10

实验材料 洋葱 酵母细胞 刚毛藻 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

实验材料 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 11 洋葱 酵母细胞 刚毛藻

实验内容 1、取新鲜洋葱鳞状叶内表皮约1cm2或更小,放在干净的载玻片上,加 小滴水,将盖玻片倾斜盖上,并注意不出现气泡,即制成水封片。 2、取一块黑纸,把它剪成暗视野显微镜用的遮光板,并放入普通光学 显微镜的聚光器下的光阑上,制成暗视野显微镜。(须反复调整遮光 板的尺寸以得到最佳效果)。 3、把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察,可以看到在 明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”或 颗粒,仔细观察,可以看出这些正作有向的运动(速度很慢),水封 片中多加些水会促进这种运动。 4、学习相差显微镜,荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关操作 技术。 5、取酵母悬液制作临时裝片,比较普通光学显微镜和相差显微镜下不 同的观察效果 6、制作刚毛藻临时装片,光学显微镜和荧光显微镜下观察 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 12

实验内容 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 12 1、取新鲜洋葱鳞状叶内表皮约1cm2 或更小，放在干净的载玻片上，加 一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。 2、取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通光学 显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮光 板的尺寸以得到最佳效果）。 3、把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察，可以看到在 明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”或 颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢），水封 片中多加些水会促进这种运动。 4、学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关操作 技术。 5、取酵母悬液制作临时装片，比较普通光学显微镜和相差显微镜下不 同的观察效果 6、制作刚毛藻临时装片，光学显微镜和荧光显微镜下观察

忘讨论 DIC 相差 暗视野 酵母 洋葱表皮 HeLa细胞 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment

讨论 5/03/2019 细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 13