《聚合酶链反应》讲义

PCR ( olymerase Chain Reaction 聚合酶链反应

PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链反应

目的 熟悉PCR技术的基本原理和操作

目 的： 熟悉PCR技术的基本原理和操作

历史 19834 Kary Mullis在开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country的 一条被月光笼罩的山路上 构思了PCR 随后卖给了 Roche公司 价格:10.000$ 1993 Nobel prize

1983.4 Kary Mullis在开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country 的 一条被月光笼罩的山路上 构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10.000$ 1993 Nobel prize 历 史

PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性90~97°C 退火45~55%C 延伸72左右 PCR过程 一生二,二生四,四生万物

PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 PCR过程

PCR引物设计 1.一对引物,分别与5和3端互补 2.长度:15~30个核苷酸 3.引物内、引物间不应有互补序列 4.引物与非特异扩增区无同源性

PCR引物设计 1. 一对引物，分别与5 ′和3′端互补 2. 长度：15～30个核苷酸 3. 引物内、引物间不应有互补序列 4. 引物与非特异扩增区无同源性

PCR反应体系的五要素 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Tag dNA聚合酶 来自水生栖热菌7 hermusaguaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校读功能

PCR反应体系的五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校读功能

PCR反应体系的准备 +Taq polymerase Thermus aquaticus +nucleotides t primers salts(ions) dna fragment

PCR反应体系的准备 + primers + nucleotides +Taq polymerase (Thermus aquaticus ) + salts (ions) + DNA fragment

Step 1: Denaturation变性 94°C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGAC GATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

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Step2: Annealing退火 primer-dependent TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGAC GATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT GCTGCTACGTAG CGTAGTAGCA CTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGC TAAACTAGCTA

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA Step 2 : Annealing 退火 T° primer-dependent CGTAGTAGCA GCTGCTACGTAG

Step3: Extension延伸 72°C Taq polyme IGAACGCAGCAGCAHAGCAATACACAG2:28平82C TACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT GCTGCTACGTAG CGTAGTAGCA TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC CTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGC TAAACTAGCTA Taq polymera

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA Step3 : Extension 延伸 72°C CGTAGTAGCA GCTGCTACGTAG Taq Polymerase Taq Polymerase TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA