华南农业大学：《农药残留分析》课程教学资源（PPT课件）第五章 高效液相色谱法（2/2）

四、分类 根据固定相对样品分子的保留机理不同主要分为以下4种类型。 1.液固吸附色谱是用高比表面积的颗粒作固定相，根据物质对吸附剂 活性表面的吸附能力的差异而进行分离。 2.液液分配色谱其固定相是由在组成上与流动相互不相溶的另一种液 体或是借化学键盒到暂粒或载使上，物质的分离是由于不同溶质在两 个液相中分配系数不同而达到的。 3.离子交换色谱固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，是根据移动 相中样本的不同离子对固定相固定电荷部位的亲和力大小不同而进行 分离。 4.凝胶色谱或空间排阻色谱固定相为不同孔径的多孔凝胶，是根据多 孔凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离

四、分 类 根据固定相对样品分子的保留机理不同主要分为以下4种类型。 1．液固吸附色谱 是用高比表面积的颗粒作固定相，根据物质对吸附剂 活性表面的吸附能力的差异而进行分离。 2．液液分配色谱 其固定相是由在组成上与流动相互不相溶的另一种液 体或是借化学键合到颗粒或载体上，物质的分离是由于不同溶质在两 个液相中分配系数不同而达到的。 3．离子交换色谱 固定相是具有固定电荷的离子交换树脂，是根据移动 相中样本的不同离子对固定相固定电荷部位的亲和力大小不同而进行 分离。 4．凝胶色谱或空间排阻色谱 固定相为不同孔径的多孔凝胶，是根据多 孔凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离

(二)液液分配色谱法 液液分配色谱法是根据样品组分在互不相溶的两种液 相中分配系数的不同（类似萃取），来实现分离分析的。 色谱柱中的固定相是涂渍在惰性载体上的液体，或 者将各种不同的有机基团化学键合到载体上，用与固定相 互不相溶的液体作流动相。 流过柱子的流动相在很大面积上与固定相接触，流动 相中的样品组分在两相间进行平衡分配，由于样品组分在 两相中的相对溶解度不同，以不同速度流出色谱柱而得到 分离

(二)液液分配色谱法 液液分配色谱法是根据样品组分在互不相溶的两种液 相中分配系数的不同(类似萃取），来实现分离分析的。 色谱柱中的固定相是涂渍在惰性载体上的液体，或 者将各种不同的有机基团化学键合到载体上，用与固定相 互不相溶的液体作流动相。 流过柱子的流动相在很大面积上与固定相接触，流动 相中的样品组分在两相间进行平衡分配，由于样品组分在 两相中的相对溶解度不同，以不同速度流出色谱柱而得到 分离

当分配达到平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在 流动相中的浓度之比即为分配系数，以K表示： KE 组分在国定相中的浓(c=K (5-16) 组分在流动相中的浓度(cm) K值大，物质在柱中停留时间长，移动速度慢，保留 体积大，保留时间长；反之K值小，移动速度快，保留时 间短

当分配达到平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在 流动相中的浓度之比即为分配系数，以K表示： （5－16） K值大，物质在柱中停留时间长，移动速度慢，保留 体积大，保留时间长；反之K值小，移动速度快，保留时 间短。 ( ) ( ) ' s m m s c V K K c V 组分在固定相中的浓度 ＝ ＝ 组分在流动相中的浓度

液液色谱中采用极性固定相和非极性溶剂作流 动相，称为正相液液色谱。 该两相也可以交换，即采用非极性固定相和极 性流动相，称为反相液液色谱。 所以通过选择适宜的固定相和流动相，可以对 非常广泛的样品类型进行分离

液液色谱中采用极性固定相和非极性溶剂作流 动相，称为正相液液色谱。 该两相也可以交换，即采用非极性固定相和极 性流动相，称为反相液液色谱。 所以通过选择适宜的固定相和流动相，可以对 非常广泛的样品类型进行分离

1.柱填充剂 (1)薄壳型填料 由30一40μm的玻璃微球表面涂覆1μm的表面多孔物质如硅胶、氧 化铝等。 (2)全多孔微粒型填料 包括硅胶、多孔硅球等。颗粒细度3一10μ，柱效高，试样容量大， 分析速度筷。 以上两种填料可作为载体，涂以适当的固定液即可作为固定相 正相液液色谱使用B,'一氧二丙腈、聚乙二醇，反相液液色谱常用角 鲨烷、氰乙基硅醇等固定液。 液液分配色谱虽有较好的分离效果和温和的色谱条件，但固定液 是以机械的方法涂覆在载体表面，很容易流失，缩短了柱子的使用寿 命，并污染了分离后的组分，基线噪音大，因此其应用受到很天限制 因而化學键合固是相便益运而主

1．柱填充剂 (1)薄壳型填料 由30一40 μm的玻璃微球表面涂覆1μm的表面多孔物质如硅胶、氧 化铝等。 (2)全多孔微粒型填料 包括硅胶、多孔硅球等。颗粒细度3－10μm，柱效高，试样容量大， 分析速度快。 以上两种填料可作为载体，涂以适当的固定液即可作为固定相。 正相液液色谱使用β，β’－氧二丙腈、聚乙二醇，反相液液色谱常用角 鲨烷、氰乙基硅醇等固定液。 液液分配色谱虽有较好的分离效果和温和的色谱条件，但固定液 是以机械的方法涂覆在载体表面，很容易流失，缩短了柱子的使用寿 命，并污染了分离后的组分，基线噪音大，因此其应用受到很大限制。 因而化学键合固定相便应运而生

(③)化学键合固定相 化学键合固定相是利用化学反应的方法，通过化学键 把有机分子结合到载体表面。它具有以下特点： ①无液相流失，增加了柱子的稳定性和使用寿命，消 除了试样被污染的可能性： ②消除了固体表面的活性点，使表面性质均一，减少 了表面的催化作用； ③表面没有液坑，比一般液体固定相传质快； ④对各种溶剂及不是太强的酸都具有化学稳定性，应 用时受流动相的限制较少，且有利于梯度洗脱； ⑤载体表面可以键合各种不同的有机基团，有助于灵 活改变选择性，适用于各种类型样本的分离。 键合固定相最初于气相色谱中应用，很快就被用于液 相色谱，并获得成功，被认为是高压液相色谱发展中的里 程碑，占有校为重要的地位。元乎80%右的分离和芬析 L- 工作可用它来解决，在农药分析中亦用得很多

(3)化学键合固定相 化学键合固定相是利用化学反应的方法，通过化学键 把有机分子结合到载体表面。它具有以下特点： ①无液相流失，增加了柱子的稳定性和使用寿命，消 除了试样被污染的可能性； ②消除了固体表面的活性点，使表面性质均一，减少 了表面的催化作用； ③表面没有液坑，比一般液体固定相传质快； ④对各种溶剂及不是太强的酸都具有化学稳定性，应 用时受流动相的限制较少，且有利于梯度洗脱； ⑤载体表面可以键合各种不同的有机基团，有助于灵 活改变选择性，适用于各种类型样本的分离。 键合固定相最初于气相色谱中应用，很快就被用于液 相色谱，并获得成功，被认为是高压液相色谱发展中的里 程碑，占有极为重 要的地位。几乎80％左右的分离和分析 工作可用它来解决，在农药分析中亦用得很多

2.化学健合固定相 化学键合固定相一般都以全多孔微柱或薄壳型硅胶为基体，先将 硅胶进行酸洗，中和，干燥活化，使其表面保持自由硅醇基，有机基 团在硅胶表面的键合型主要有： (1)酯化键合(SO一C型)，它是由硅醇基与各种醇如氯乙醇、正辛 醇、聚乙二醇等在一定温度下加热酯化后生成的单分子键合固定相。 Si一OH+R-HO 150-250℃ 3-8h Si—OR+H2O 酯化后的有机基团像刷毛一样排列在硅胶表面，又称刷状固定相。 这类固定相的S一O一C键容易断裂，当用极性强的溶剂如水、醇等、 键合的有机基团易被水解或醇解，所以只能在正相色谱中使用极性小 的溶剂

2．化学健合固定相 化学键合固定相一般都以全多孔微柱或薄壳型硅胶为基体，先将 硅胶进行酸洗，中和，干燥活化，使其表面保持自由硅醇基，有机基 团在硅胶表面的键合型主要有： (1)酯化键合(Si—O—C型)，它是由硅醇基与各种醇如氯乙醇、正辛 醇、聚乙二醇等在一定温度下加热酯化后生成的单分子键合固定相。 酯化后的有机基团像刷毛一样排列在硅胶表面，又称刷状固定相。 这类固定相的Si—O—C键容易断裂，当用极性强的溶剂如水、醇等、 键合的有机基团易被水解或醇解，所以只能在正相色谱中使用极性小 的溶剂。 Si OH＋R HO 150－250℃ 3－8h Si OR＋H2O

(2)硅烷化键合(S一O一Si一C型)是以氯硅烷与硅胶表面羟基作用并聚 合交联成网状结构而得。 Si-OH HO- Cl3SiR O Cl3SiR Si-OH OH OH 如使用较大的硅烷化试剂时，硅胶表面的硅醇基不能完全参与键 合反应，在非极性键合相中硅醇基使极性化合物色谱峰拖尾，为此可 在键合反应后，用小分子的三甲基氯硅烷进行补充硅烷化，以尽量减 少硅醇基。 Si一O一Si一C型是目前应用最厂泛的键合相，具有相当的耐热 性与化学稳定性，在70C以下和pH2一8范围内都可工作

(2)硅烷化键合(Si—O—Si一C型)是以氯硅烷与硅胶表面羟基作用并聚 合交联成网状结构而得。 如使用较大的硅烷化试剂时，硅胶表面的硅醇基不能完全参与键 合反应，在非极性键合相中硅醇基使极性化合物色谱峰拖尾，为此可 在键合反应后，用小分子的三甲基氯硅烷进行补充硅烷化，以尽量减 少硅醇基。 Si—O—Si—C型是目前应用最厂泛的键合相，具有相当的耐热 性与化学稳定性，在70℃以下和pH 2—8范围内都可工作。 Si O OH Si O Si OH OH Cl3SiR Si O O Si Si O O OH Si OH R Cl3SiR HO Si R O OH Si O Si O O Si O O Si O O Si O O Si Si OH R Si R R

反相键合相色谱用的固定相表面部是极性小的烃基， 如十八烷基、辛烷基和苯基等，而采用强极性溶剂如水、 甲醇、乙腈或无机吾的缓冲液作为流动相。，其洗脱次序与 正相色谱相反、极性大的化合物先洗脱(K小)，极性小的 化合物不易洗脱(K'大)，十八烷基键合相（简称C18或ODS) 用得最多，可用于各种类型样品的分析，辛基和苯基键合 相這角子分析极性样品。 ▣ 固定相表面键合极性有机基团称为极性键合相，最 常用的有氰基(CN键合相，其性质与硅胶相似，极性较硅 胶弱，在正相色谱中使用，以非极性或极性小的溶剂（如烃 加入适量极性溶剂（如氯仿、，甲醇、乙腈等）以调节控制 洗脱液的强度，极性弱的先出峰

反相键合相色谱用的固定相表面部是极性小的烃基， 如十八烷基、辛烷基和苯基等，而采用强极性溶剂如水、 甲醇、乙腈或无机盐的缓冲液作为流动相。其洗脱次序与 正相色谱相反、极性大的化合物先洗脱(K’小)，极性小的 化合物不易洗脱(K’大)，十八烷基键合相(简称C18或ODS) 用得最多，可用于各种类型样品的分析，辛基和苯基键合 相适用于分析极性样品。 固定相表面键合极性有机基团称为极性键合相，最 常用的有氰基(CN)键合相，其性质与硅胶相似，极性较硅 胶弱，在正相色谱中使用，以非极性或极性小的溶剂(如烃 类)加入适量极性溶剂(如氯仿、甲醇、乙腈等)以调节控制 洗脱液的强度，极性弱的先出峰

3.液液分配色谱流动相 在常规液液色谱中，使用极性固定相和非极性或弱极性流动相， 极性最弱的组分先流出，增加流动相的极性将降低洗脱时间，反相色 谱法则相反，是使用极性或弱极性固定相和极性流动相，极性最强的 组分最先流出，流动相是水和甲醇或水和乙腈的混合物，增加流动相 的极性将增加洗脱时间，即水的浓度加大，增加保留时间，甲醇或乙 腈的浓度增大，使保流时间减少。 正相和反相液液色谱的区别： 正相 反相 固定相极性 极性大或中等 极性小或中等 溶剂极性 极性小或中等 极性中等或大 样本洗脱次序 非极性先出来 极性强先出来 增加溶剂极性的效果 降低洗脱时间 增加洗脱时间

3．液液分配色谱流动相 在常规液液色谱中，使用极性固定相和非极性或弱极性流动相， 极性最弱的组分先流出，增加流动相的极性将降低洗脱时间，反相色 谱法则相反，是使用极性或弱极性固定相和极性流动相，极性最强的 组分最先流出，流动相是水和甲醇或水和乙腈的混合物，增加流动相 的极性将增加洗脱时间，即水的浓度加大，增加保留时间，甲醇或乙 腈的浓度增大，使保流时间减少。 正相和反相液液色谱的区别： 正相 反相 固定相极性 极性大或中等 极性小或中等 溶剂极性 极性小或中等 极性中等或大 样本洗脱次序 非极性先出来 极性强先出来 增加溶剂极性的效果 降低洗脱时间 增加洗脱时间