《生化技术》课程教学资源（PPT课件讲稿）第七章 光学检测技术

第七章光学检测技术 ■利用物质所具有的各种光学性质,对物质 进行定性、定量及结构分析的技术 ■包括:旋光检测、析光检测、荧光检测 分光光度检测、散射光谱检测等。 生化领域常用:分光光度检测、旋光检测 荧光检测

第七章 光学检测技术 ◼ 利用物质所具有的各种光学性质，对物质 进行定性、定量及结构分析的技术。 ◼ 包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、 分光光度检测、散射光谱检测等。 ◼ 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、 荧光检测

分光光度检测 ■又称分子吸收光谱检测,是利用物质分子 所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量 测定的检测技术。 ■紫外分光光度检测(200~400mm ■可见光分光光度检测(400~760nm) ■红外光分光光度检测(760~10000nm)

一 分光光度检测 ◼ 又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子 所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量 测定的检测技术。 ◼ 紫外分光光度检测（200～400nm） ◼ 可见光分光光度检测（400～760nm） ◼ 红外光分光光度检测（760～10000nm）

,2, 1样品溶液的配备 ■(1)对各种光有选择性吸收特性的物质 (2)本身没有颜色的物质,转变为有色 的物质溶液 2样品的检测 ■选择好入射光的波长,空白液调零,测 定

◼ 1 样品溶液的配备 ◼ （1）对各种光有选择性吸收特性的物质 ◼ （2）本身没有颜色的物质，转变为有色 的物质溶液 ◼ 2 样品的检测 ◼ 选择好入射光的波长，空白液调零，测 定

■3待测物质的定性分析 (1)将样品溶液在一定条件下(pH、温度 缓冲液等)测得的吸收光谱与物质的标准吸收 光谱相对照,推断样品是什么。 2)根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度 之比值,与相当条件下资料所载的比值比较, 推断样品是什么 ATP:OD280/OD260=0.85,OD250/OD26=0.90 AMP:OD250/0D260=0.85,OD280OD26=0.22 (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配 合,综合判断

◼ 3 待测物质的定性分析 ◼ （1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、 缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收 光谱相对照，推断样品是什么。 ◼ （2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度 之比值，与相当条件下资料所载的比值比较， 推断样品是什么。 ◼ 如 ◼ ATP: OD280/OD260=0.85, OD250/ OD260=0.90 ◼ AMP: OD250/OD260=0.85, OD280/OD260=0.22 ◼ (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配 合，综合判断

■4待测物质的定量分析 (1)标准曲线法 注意:对于存在有干扰物质的样品要进 行校正 (2 Lambert-Beer E=KCL,K-消光系数

◼ 4 待测物质的定量分析 ◼ （1）标准曲线法 注意：对于存在有干扰物质的样品要进 行校正。 ◼ （2）Lambert-Beer E=KCL, K-消光系数

旋光检测技术 ■利用旋光计测量出旋光物质(光学浩性物质) 对偏振光旋转角度的方向(左旋或右旋)和大 小,从而进行定性与定量分析的技术,称为旋 光检测技术。 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该 物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称 为旋光度。左旋(-),右旋(+)。 ■物质的旋光度主要取决于物质本身的结构,此 外与入射光的波长及温凌有关,对溶液而言, 还与熔液性质、溶浪浓度和熔浪厚度有密切关 系

二 旋光检测技术 ◼ 利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质） 对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大 小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋 光检测技术。 ◼ 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该 物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称 为旋光度。左旋（－），右旋（＋）。 ◼ 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此 外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言， 还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关 系

■溶剂确定后, =[axLC/100 旋光度L一溶液厚度(分米) [a]入一比旋光度,通常采用[a120 L一溶液厚度(分米) C一溶液浓度,100mL溶液中所含物质 的克数 根据物质的[a]20和实际测出的a,可 计算得到C=a×100/([a]L

◼ 溶剂确定后， ◼ α ＝[α] t λ LC/100 ◼ α － 旋光度 L －溶液厚度（分米） [α] t λ －比旋光度，通常采用[α] 20 D L －溶液厚度（分米） C－溶液浓度，100mL溶液中所含物质 的克数。 ◼ 根据物质的[α] 20 D 和实际测出的α，可 计算得到C= α× 100/ ([α] t λ L)

■操作要点: (1)样品液的配制 (2)旋光度的测定

◼ 操作要点： ◼ （1）样品液的配制 ◼ （2）旋光度的测定

旋光法测定味精浓度 ■样品溶液配制 精确称取味精样品10.00g,加40~50m蒸馏 水溶解,搅拌加入分析纯盐酸16mL,使味精 全部溶解。冷却至室温,蒸馏水定容至100mL 旋光仪调零 ■预热10min,放进滤光片。取16mL分析纯盐酸 蒸馏水定容至100mL。装满旋光管,调整零点。 ■样品液测定 ■样品洗涤旋光管三次,装满旋光管,放进样品 室,测定旋光度,记录温度

旋光法测定味精浓度 ◼ 样品溶液配制 ◼ 精确称取味精样品10.00g，加40～50mL蒸馏 水溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精 全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。 ◼ 旋光仪调零 ◼ 预热10min，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸 蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。 ◼ 样品液测定 ◼ 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品 室，测定旋光度，记录温度

■计算 C=a×100/(∝1L) [a]=32+0.06×(20-t) 味=C×187.13/147.13 味精纯度=C味/样品重量

◼ 计算 ◼ C= α× 100/ ([α] t λ L) ◼ [α] t λ＝32＋0.06×（20－t) ◼ C味=C×187.13/147.13 ◼ 味精纯度＝ C味/样品重量