苏州大学：《医用基因工程》第十章 重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选

GNEis 重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选?

重组DNA导入宿主细 胞与转化子的筛选?

第一节重组DNA向宿主细胞的导入 第二节转化子的筛选与鉴定 第三节目的基因序列测定

• 第一节 重组DNA向宿主细胞的导入 • 第二节 转化子的筛选与鉴定 • 第三节 目的基因序列测定

第一节重组DNA向宿主细 胞的导入 、转化 通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染转导作用传递遗传物质

第一节 重组DNA向宿主细 胞的导入 一、转化 二、通过接合作用传递质粒DNA 三、通过转染/转导作用传递遗传物质

、转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导 入宿主细胞 1928年,美国的 Oswald, Avery首次开展了肺炎球菌的转 化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的 状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、 嗜血杆菌。有的在对数生长期发生,如 E coli。产生机 制不明。一是原生质体假说,另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞(感受态细菌)从 周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而 使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象 常见转化方法有()原生质体转化法;化学转化法;(电 穿孔法

一、转化 : 以质粒作为克隆载体将目的基因导 入宿主细胞 1928年, 美国的Oswald, Avery 首次开展了肺炎球菌的转 化试验 感受态细菌是指细菌处于容易接受外源DNA的 状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、 嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机 制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从 周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而 使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。 常见转化方法有㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电 穿孔法

()原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA,经 吸收恢复再生培养,如枯草杆菌。 (化学转化法:1970年 Mandel和Hga首先用CaCl2 经短暂的热休克后,可使外源DNA转入 E coli 1.原理:将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的 CaCL溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜 通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细 菌的细胞内。 用冷CaC2低渗处理Ecoi使菌体成球形, 外源DNA可形成抗 DNase的羟基-钙磷酸复合物而 被吸附,经短暂42℃热休克,易于进入胞内而不 被降解,转化效率达105-106,它与菌株(hsdR) 2方法 1)感受态细菌的制备(2)转化

㈠ 原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经 吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。 ㈡ 化学转化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2 经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。 1.原理：将对数生长期的细菌在0℃下, 用预冷的 CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁和细胞膜 通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细 菌的细胞内 。 用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形， 外源DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而 被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不 被降解，转化效率达105 -106，它与菌株（hsdR- ). 2.方法 : （1）感受态细菌的制备 （2）转化

(1)感受态细菌的制备 接种一环DH5a于2mlLB中37℃,振荡过夜 以约1%的接种量接入20mLB中 振荡培养约90至OD600.2离心(K,5) 收集菌体—一加入预冷CaC12(10ml100mM) 冰浴20 离心收集菌体 加入 100u00mM预冷CaCl2混匀

（1）感受态细菌的制备 接种一环DH5于2ml LB中 37℃，振荡过夜 以约1%的接种量接入20ml LB中 振荡培养约90’至OD600≈0.2 离心（5K，5’） 收集菌体 加入预冷CaCl2（10 ml 100mM） 冰浴20’ 离心 收集菌体 加入 100ul100mM预冷CaCl2混匀

(2)转化:0℃,在1.5m1离心管中按下表加入 CaC2、受体菌及DNA进行转化实验 转化项目 CaCl2受体菌 DNA 液体LB 皿 a阳性对照 10ul PBR322DNAlng 100ul b阴性对照① 2ul连接液 100ul c阴性对照② 1 Oul 100ul d连接液转化组 60ul 6ul连接液 600ul 冰浴303—42℃2(热休克)一冰浴,2 加37℃预热LB培养45表中a、b、c各取100ul/皿 涂布(连接液转化组d梯度涂布Ⅰ50ul×2皿 Ⅱ500u浓缩后×2皿) 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况

转化项目 CaCl2 受体菌 DNA 液体LB 皿 a阳性对照 —— 10ul PBR322DNAlng 100ul b阴性对照① 10ul —— 2ul连接液 100ul c阴性对照② —— 10ul —— 100ul d连接液转化组 —— 60ul 6ul连接液 600ul （2）转化： 0℃，在1.5ml离心管中按下表加入 CaCl2、受体菌及DNA进行转化实验 冰浴30’ 42℃ 2’（热休克） 冰浴，2’ 加37℃预热LB培养45’ 表中a、b、c各取100ul/皿 涂布（连接液转化组d梯度涂布 I 50ul2皿； II.500ul浓缩后2皿） 37℃倒置培养过夜 检查细菌生长情况

(电穿孔法 原理:利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入 在脉冲过后,微孔复原。 它比CaCl法操作更简单,转化效率高 (一般可达109~1010个转化子/g DNA),不仅无需制备感受态细胞,而且 适用于任何菌株

㈢电穿孔法 原理：利用高压脉冲电场, 在宿主细胞表面 形成暂时性的微孔, 质粒DNA可乘隙而入, 在脉冲过后, 微孔复原 。 它比CaCl2法操作更简单，转化效率高 （一般可达109～1010个转化子／μg DNA）, 不仅无需制备感受态细胞, 而且 适用于任何菌株

通过接合作用传递质粒DNA F质粒(F因子)又称性质粒,除了含有自我复 制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有F质 粒的细菌称F菌株。不带有F质粒的细菌称F菌株。 F菌株(供体菌)一旦与Fˉ菌株(受体菌)发生接 触,F菌株可通过性菌毛将F质粒转给Fˉ菌株,使F 菌株转变成F菌株。质粒由F向Fˉ菌的转移过程 叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 (H株系)。H株系不稳定,F质粒可发生接合传 递质粒DNA,F菌株可失去F质粒,F菌也可获得F质 粒,其转移难以人为控制,又不稳定,通常不用作克 隆载体

二、通过接合作用传递质粒DNA F质粒（F因子）又称性质粒, 除了含有自我复 制基因外, 还带有一套接合转移的基因, 凡携有F质 粒的细菌称F +菌株。不带有F质粒的细菌称F－菌株。 F +菌株（供体菌）一旦与F－菌株（受体菌）发生接 触，F +菌株可通过性菌毛将F质粒转给F－菌株，使F －菌株转变成 F +菌株。质粒由F +向F－菌的转移过程 叫接合作用传递质粒, 又称质粒的接合传递。凡带有 在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系 （Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传 递质粒DNA, F+菌株可失去F质粒, F－菌也可获得F质 粒, 其转移难以人为控制,又不稳定， 通常不用作克 隆载体

接合 F+×F Donor F Recipient

接合---- F +×F－ F + F - F + F - F + F + F + F + Donor Recipient