苏州大学：《医用基因工程》第六章 分子克隆常用的载体

Cloning Veetor

Cloning Vectors

二、基因工程的基本程序 剪切 载体质粒 选出含有重 引入宿 →组DNA的细 主细胞 胞扩增表达 外源DNA片段外源DNA插入

二、基因工程的基本程序 载体质粒 外源DNA片段 外源DNA插入 剪切 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达 a b b A A b

第六章分子克隆常用的载体 ●第一节质粒载体 ●第二节菌体载体 ●第三节真核细胞的克隆载体

第六章 分子克隆常用的载体 ⚫第一节 质粒载体 ⚫第二节 噬菌体载体 ⚫第三节 真核细胞的克隆载体

第一节质粒载体 一、质粒的基本特性 二、质粒的分离纯化方法 三、质粒载体的选择 四、大肠杆菌质粒载体 ●五、多种功能的衍生质粒的组建

第一节 质粒载体 ⚫ 一、质粒的基本特性 ⚫ 二、质粒的分离纯化方法 ⚫ 三、质粒载体的选择 ⚫ 四、大肠杆菌质粒载体 ⚫ 五、多种功能的衍生质粒的组建

质粒的基本特性 ●1.质粒及其命名 2.质粒的种类 ●3.质粒的复制类型 4.质粒的分子生物学特征

一、质粒的基本特性 ⚫ 1．质粒及其命名 ⚫ 2．质粒的种类 ⚫ 3．质粒的复制类型 ⚫ 4．质粒的分子生物学特征

质粒的分离纯化方法 1.氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯 度分离法(图3-3) Triton和PEG化学提取法 ●3.煮沸裂解菌体,异丙醇沉淀质粒 4.碱变性法抽提质粒DNA

二、质粒的分离纯化方法 ⚫ 1．氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯 度分离法 （图3-3） ⚫ 2. Triton和PEG化学提取法 ⚫ 3．煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA ⚫ 4．碱变性法抽提质粒DNA

●质粒的存在形式:呈共价闭合环状 ①超螺旋的SC构型(cDNA ②松弛开环的OC型( OCDNA ③松弛线性的L构型(cDNA) 基本步骤: 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化

⚫ 质粒的存在形式：呈共价闭合环状 ①超螺旋的SC构型 （cccDNA） ②松弛开环的OC型 （ocDNA） ③松弛线性的L构型（cDNA） 基本步骤： 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化

氯化铯浮密度分离法 当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在 下进行氯化铯密度梯度离心时,与共价闭环状 分子结合的染料要大大少于与开环状或线状 DNA的结合,因此,在氯化铯梯度离心中质料 DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密 度范围内,而断裂为线状的染色体DNA与溴乙 锭结合较多,生成的条带是低密度范围。所以, 离心后形成2条带,上面的条带主要是染色体 DNA及少量开环状质粒DNA,下面的带则是共 价闭合环状质粒DNA

氯化铯浮密度分离法 当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在 下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状 分子结合的染料要大大少于与开环状或线状 DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒 DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密 度范围内，而断裂为线状的染色体DNA与溴乙 锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以， 离心后形成2条带，上面的条带主要是染色体 DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共 价闭合环状质粒DNA

变性法抽提质粒DNA 该法也是一种快速抽提质料DNA的方法 其分离原理,大肠杆菌的染色体约有4700KB 长,在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双 链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链 DNA中的氢键被破坏,于是染色体DNA的双链 便分离成单链,而超螺旋状态的质粒DNA仅仅 是氢链被破坏,并只发生部分双链解离成单链 的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠 绕且与蛋白质结合生成网络状大分子,而超螺 旋的质粒发生复性反应后仍是小分子,通过离 心的方法很容易将二者分开,达到分离的目的

碱变性法抽提质粒DNA 该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。 其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB 长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双 链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链 DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链 便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅 是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链 的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠 绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺 旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离 心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的

、质粒载体的选择 作为理想的质粒载体,应具备以下几 条件(1)能自主复制,即本身是复制 子(2)具有一种或多种限制酶的单一切 割位点,并在此位点中插入外源基因片 段,不影响本身的复制功能;(3)在基 因组中有1-2个筛选标记,为寄主细胞提 供易于检测的表型特征,(4)分子量要 小,多拷贝,易于操作

三、质粒载体的选择 作为理想的质粒载体，应具备以下几 个条件（1）能自主复制，即本身是复制 子（2）具有一种或多种限制酶的单一切 割位点，并在此位点中插入外源基因片 段，不影响本身的复制功能；（3）在基 因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提 供易于检测的表型特征，（4）分子量要 小，多拷贝，易于操作