苏州大学：《医用基因工程》第九章 目的基因的分离和克隆

第九章的基因的分离和克隆 第一节目的基因的获得 第二节获得目的基因方法的选择 第三节且的基因重组体的构建

第九章 目的基因的分离和克隆 • 第一节 目的基因的获得 • 第二节 获得目的基因方法的选择 • 第三节 目的基因重组体的构建

第一节且的基因的获得 一、化学合成 聚合酶链反应(PCR)方法扩增目 的基因 三、建立基因组DNA文库 四、构建cDNA文库筛选目的基因 五、其他方法

第一节 目的基因的获得 • 一、化学合成 • 二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目 的基因 • 三、建立基因组DNA文库 • 四、构建cDNA文库筛选目的基因 • 五、其他方法

化学合成法自动化DNA合成仪 1要求:1)已知目的基因的核苷酸序列或其对 应的多肽链氨基酸序列 2)较短的DNA片段,有专一性和定 向性 2原理:第一个核苷酸固定于不溶性的固相载 体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始,以3 5-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应(封 闭非反应基团),其后用洗涤法除去多余的反 应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷 酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸 链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化

一、化学合成法 自动化 DNA合成仪 • 1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对 应的多肽链氨基酸序列 • 2）较短的DNA片段，有专一性和定 向性 • 2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载 体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、 5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封 闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反 应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个核苷 酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核苷酸 链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步纯化

应用范围:1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探针 3)人工接头及较小的基因

• 应用范围：1）合成PCR引物 • 2）寡核苷酸探针 • 3）人工接头及较小的基因

、建立基因组DNA文库 基因组文库:分离真核生物中某种DNA成分 通常是分离供体细胞中的染色体DNA,酶 切后,将这些染色体DNA片段与某种载体 相接,而后转入大肠杆菌,建立包含有真 核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克 隆株群体 1.特点:提供全套遗传信息,即完整的基因组 DNA,可以研究基因组中5端控制基因转录 的调控序列,内含子的分布和作用,以及重 复序列的数量分布及大小

二、建立基因组DNA文库 基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶 切后，将这些染色体DNA片段与某种载体 相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真 核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克 隆株群体。 1.特点：提供全套遗传信息, 即完整的基因组 DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录 的调控序列, 内含子的分布和作用, 以及重 复序列的数量分布及大小

2构建基因组文库全过程(DNA重组的过程) (1)分离纯化基因组DNA 提取哺乳动物细胞染色体DNA (2)制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入 载体之前还需要进行修饰加工,少用 ②限制性内切酶降解(鸟枪法) 过去用 ECoR I,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与 处理过的载体连接

2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程 ） ⑴ 分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入 载体之前还需要进行修饰加工，少用 ②限制性内切酶降解（鸟枪法） 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接

(3)DNA片断与载体的连接包装 常用载体:粘性质粒λ噬菌体 酵母人工染色体 ①基因组DNA+粘性质粒—重组DNA 转化细菌菌落 ②基因组DNA+λ噬菌体—重组DNA 包装成噬菌体——感染细菌—噬菌斑 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和

• ⑶ DNA片断与载体的连接包装 • 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体 • 酵母人工染色体 • ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA— —转化细菌 菌落 • ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA— 包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 • 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和

基因组文库大小的计算 1975年 L. Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重 组体所需实际克隆数(N)的公式: In(1-P) N In(1-f P为在基因组文库目的基因出现的几率(一般为99%);f为 插入的限制片断长度/整个基因组DNA总长度。 例如:从人基因组DNA(总长度为3×10%bp)的文库中筛选 到长约1.5kb目的基因的可能性为99%,那么这个基因组文 库要多大? In(1-0.99) N 9.2×106 In(1-1.5×103/3×109)

基因组文库大小的计算 1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重 组体所需实际克隆数（ N ）的公式： In（1－P） N = ——————— In （1－f） P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为 插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。 例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选 到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文 库要多大？ In（1－0.99） N = ——————————————— = 9.2×106 In （1－1.5×103／3×109）

若用质粒(pBR322)克隆目的基因(1.5kb) 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因 的人基因组DNA文库,按上式计算所需要的重 组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右均可满足建库要求 表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较 载体种类 装载量 转染率 λ噬菌体 9~22kb 105~10转化子/gDNA 粘性质粒 Cosmid)30~4kb10+~10转化子/gDNA 酵母人工染色体 100~1000kb 500转化子/ HgDNA (YAC)

• 若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb） 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若 用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因 的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重 组体克隆数可以减少到9×105 , 而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右,均可满足建库要求。 载体种类 装载量 转 染 率 λ噬菌体 粘性质粒 (Cosmid) 酵母人工染色体 (YAC) 9～22kb 30～45kb 100～1000kb 105～106转化子／μgDNA 104～106转化子／μgDNA ～500转化子／μgDNA 表4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较