佛山大学：《高级动物组织学》课程教学课件（实验讲义）石蜡切片、PAS和血涂片实验步骤

实验一石蜡切片制备方法石蜡切片技术是研究组织学、胚胎学和病理学等学科最基本的方法。制备步骤是：从动物体取下小块组织，经固定、脱水、浸蜡、包埋和切片等处理，把要观察的组织或器官切成薄片，再经不同的染色方法，以显示组织的不同成分和细胞的形态，达到既易于观察、鉴别，又便于保存，是教学和科研常用的方法。其具体步骤如下：1.取材与固定实验室常用的单一固定液是：5%或10%甲醛固定液（取市售37%-40%甲醛溶液5ml或10ml，加蒸馏水95ml或90ml）；此外，乙醇、重铬酸钾也是切片制作常用的固定剂2.修组织块与冲洗可用单面刀片把组织块修整成所需要的大小。3.脱水与透明脱水的自的在于用乙醇（脱水剂）完全除去组织内水分。实验室常从70%乙醇开始脱水，80%、95%至无水乙醇逐级更换，最后完全把组织中水分置换出来。每级乙醇脱水时间约2h。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿等。一般先将组织块放于无水乙醇与透明剂（1：1）的混合液内10~30分钟，再移入透明剂I、II中各15分钟。4.浸蜡与包埋浸蜡的目的在于除去组织中的二甲苯而代以石蜡。把透明好的组织块投入熔化的蜡中，经2～6次更换石蜡，每次45min，总浸蜡时间为2～3h，便可完全置换出组织内的二甲苯。包埋是把浸好蜡的组织块转入石蜡中，使其冷却凝固形成包有组织的蜡块。5.修蜡块和切片把包有组织块的长条蜡块，用单面刀片分割成以组织块为中心的正方形或长方形，然后在蜡块底面（即切面）修成以组织块为中心、组织块边距为2mm、高3～5mm的正方形或长方形蜡块。一般组织器官切片厚度为5~7Hm。6.展片与贴片把蜡片直接置于40-45℃水中展片），待蜡片的皱褶完全展平时（勿使蜡片溶解），倾斜载玻片除去多余的水分（或用载玻片捞取水中蜡片），并放入40℃烘箱内烘干待用。7.染色教学和科研最常用的染色方法之一是苏木精一伊红（HE）染色法。①染色前准备工作

实验一 石蜡切片制备方法 石蜡切片技术是研究组织学、胚胎学和病理学等学科最基本的方法。制备步骤是：从动 物体取下小块组织，经固定、脱水、浸蜡、包埋和切片等处理，把要观察的组织或器官切成 薄片，再经不同的染色方法，以显示组织的不同成分和细胞的形态，达到既易于观察、鉴别， 又便于保存，是教学和科研常用的方法。其具体步骤如下： 1．取材与固定 实验室常用的单一固定液是：5％或 10％甲醛固定液（取市售 37%-40%甲醛溶液 5ml 或 10ml，加蒸馏水 95ml 或 90ml）；此外，乙醇、重铬酸钾也是切片制作常用的固定剂。 2．修组织块与冲洗 可用单面刀片把组织块修整成所需要的大小。 3．脱水与透明 脱水的目的在于用乙醇（脱水剂）完全除去组织内水分。实验室常从 70％乙醇开始脱 水，80％、95％至无水乙醇逐级更换，最后完全把组织中水分置换出来。每级乙醇脱水时间 约 2h。 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿等。一般先将组织块放于无水乙醇与透明剂（1：1） 的混合液内 10~30 分钟，再移入透明剂Ⅰ、Ⅱ中各 15 分钟。 4．浸蜡与包埋 浸蜡的目的在于除去组织中的二甲苯而代以石蜡。把透明好的组织块投入熔化的蜡中， 经 2～6 次更换石蜡，每次 45min，总浸蜡时间为 2～3h，便可完全置换出组织内的二甲苯。 包埋是把浸好蜡的组织块转入石蜡中，使其冷却凝固形成包有组织的蜡块。 5．修蜡块和切片 把包有组织块的长条蜡块，用单面刀片分割成以组织块为中心的正方形或长方形，然 后在蜡块底面（即切面）修成以组织块为中心、组织块边距为 2 ㎜、高 3～5 ㎜的正方形或 长方形蜡块。一般组织器官切片厚度为 5～7µm。 6．展片与贴片 把蜡片直接置于 40-45℃水中展片），待蜡片的皱褶完全展平时（勿使蜡片溶解），倾斜 载玻片除去多余的水分（或用载玻片捞取水中蜡片），并放入 40℃烘箱内烘干待用。 7．染色 教学和科研最常用的染色方法之一是苏木精—伊红（HE）染色法。 ①染色前准备工作

A.配制Delafields苏木精染色液取：苏木精4g无水乙醇25ml铵矾（硫酸铝铵）40g蒸馏水400mlB.配制伊红（曙红）染色液实验室一般常用的伊红溶液：伊红1g，溶于99ml95%乙醇或溶于100ml蒸馏水中。C.配制90%、80%、70%乙醇及酸乙醇方法：分别取95%乙醇90ml，80ml和70ml，分别加入5ml、15ml及25ml蒸馅馏水即成。酸乙醇则在70%乙醇中加入儿滴浓酸即成。D.切片的染色前处理：烘干的切片在二甲苯中溶蜡，在各级浓度乙醇中逐步复水，方可染色。方法：切片经二甲苯I、Ⅱ（各5min）脱蜡→无水乙醇I、ⅡI（各2min）→95%、80%、70%乙醇（各2min）→蒸馏水洗去酒精，待染色。②苏木精染色将复水后的切片置于Delafield's苏木精原液中，染25min（染510min后可取样镜检，胞核着深紫红色，清晰可见即可）→自来水洗去残留染料5-10min→蒸馏水洗2min→1%盐酸酒精分色1-30s（严格控制时间）→自来水蓝化（30min～数小时，切片从淡紫红色转变为鲜艳的蓝色即可）→蒸馏水洗2min，待染伊红。③伊红染色从蒸馏水中取出切片，置于70%、80%、90%、95%乙醇中逐级脱水各2-5min→伊红酒精染色液1-5min→95%乙醇I、I1秒～1min→无水乙醇I、II各2min→二甲苯I、I透明各5min。（其它染色法，如镀银法、铁苏木精染色、Best卡红染色等染色法，与HE染色相似，可参照其它组织学制片书籍）8.封片从二甲苯Ⅱ中逐个取出载玻片，分辨出正面（有组织一面）和底面，然后向组织切片上滴加1～2滴树胶（封片剂）。用镊子夹取一干净盖玻片，倾斜地盖在树胶上即可（注意防止气泡侵入组织内）。然后平放于木盒内，烘干或自然干燥即可镜下观察

A. 配制 Delafield′s 苏木精染色液 取：苏木精 4ɡ 无水乙醇 25ml 铵矾（硫酸铝铵） 40ɡ 蒸馏水 400ml B.配制伊红（曙红）染色液 实验室一般常用的伊红溶液：伊红 1ɡ，溶于 99ml 95％乙醇或溶于 100ml 蒸馏水中。 C.配制 90％、80％、70％乙醇及酸乙醇 方法：分别取 95％乙醇 90ml，80ml 和 70ml，分别加入 5ml、15ml 及 25ml 蒸馏水即成。 酸乙醇则在 70％乙醇中加入几滴浓盐酸即成。 D.切片的染色前处理：烘干的切片在二甲苯中溶蜡，在各级浓度乙醇中逐步复水，方 可染色。 方法：切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各 5 min）脱蜡 → 无水乙醇Ⅰ、Ⅱ（各 2 min） → 95％、 80％、70％乙醇（各 2min） → 蒸馏水洗去酒精，待染色。 ②苏木精染色 将复水后的切片置于 Delafield′s 苏木精原液中，染 25 min（染 5～10 min 后可取样镜检，胞核着深紫红色，清晰可见即可） → 自来水洗去残留染料 5-10min → 蒸馏水洗 2min→ 1％盐酸酒精分色 1-30s（严格控制时间） → 自来水蓝化（30 min～数 小时，切片从淡紫红色转变为鲜艳的蓝色即可） → 蒸馏水洗 2min，待染伊红。 ③伊红染色 从蒸馏水中取出切片，置于 70％、80％、90%、95％乙醇中逐级脱水各 2-5 min → 伊红酒精染色液 1-5min→ 95％乙醇Ⅰ、Ⅱ1秒～1 min → 无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各 2min →二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各 5min。（其它染色法，如镀银法、铁苏木精染色、Best 卡红染色等染 色法，与 HE 染色相似，可参照其它组织学制片书籍） 8．封片 从二甲苯Ⅱ中逐个取出载玻片，分辨出正面（有组织一面）和底面，然后向 组织切片上滴加 1～2 滴树胶（封片剂）。用镊子夹取一干净盖玻片，倾斜地盖在树胶上即可 （注意防止气泡侵入组织内）。然后平放于木盒内，烘干或自然干燥即可镜下观察

PAS反应实验二、一、目的和要求掌握PAS（高碘酸-希夫试剂)反应显示多糖的方法，了解多糖在细胞内的分布及其特性。二、仪器、设备和材料（一）试剂的配制1.0.7%高碘酸（HI04)水溶液。2.希夫试剂将1克碱性品红溶于200毫升沸腾的蒸馏水中，摇动5一10分钟，冷却到50℃时过滤。向滤液中加入1NHC120毫升，冷至25℃，加2克偏亚硫酸钾（或钠盐），摇匀，静置暗处过夜。加活性炭2克，摇动2一3分钟，用滤纸将溶液过撼于棕色瓶中。滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能用。用前将染液升到室温。低温黑暗储存。根据我们的经验：使偏亚硫酸钾2一3倍于碱性品红，可增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下，即可使碱性品红变成无色，不用活性炭去色过滤，3.洗涤液一一偏亚硫酸钾（或钠）溶液5毫升10%偏亚硫酸钾100毫升1N HC15毫升100毫升蒸馏水90毫升1800毫升临用时将三者混合，使用新鲜混合液。4.Carnoy固定液95%酒精30毫升冰醋（乙）酸10毫升5.0.7%过碘酸溶液4.2克HI0600毫升H20（二）材料小白鼠三、实验原理

实验二、 PAS 反应 一、目的和要求 掌握 PAS(高碘酸-希夫试剂)反应显示多糖的方法，了解多糖在细胞内的分布 及其特性。 二、仪器、设备和材料 （一）试剂的配制 1．0．7％高碘酸(HI04)水溶液。 2．希夫试剂 将 l 克碱性品红溶于 200 毫升沸腾的蒸馏水中，摇动 5—10 分钟，冷却到 50℃时过滤。向滤液中加入 1N HCl20 毫升，冷至 25℃，加 2 克偏亚硫酸钾(或 钠盐)，摇匀，静置暗处过夜。加活性炭 2 克，摇动 2—3 分钟，用滤纸将溶液过 摅于棕色瓶中。滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能用。用前将染液升到 室温。低温黑暗储存。根据我们的经验：使偏亚硫酸钾 2—3 倍于碱性品红，可 增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下，即可使碱性品红变成无色， 不用活性炭去色过滤。 3．洗涤液一一偏亚硫酸钾(或钠)溶液 10％偏亚硫酸钾 5 毫升 100 毫升 1N HCl 5 毫升 100 毫升 蒸馏水 90 毫升 1800 毫升 临用时将三者混合，使用新鲜混合液。 4．Carnoy 固定液 95％酒精 30 毫升 冰醋（乙）酸 10 毫升 5. 0.7%过碘酸溶液 4.2 克 HIO4 600 毫升 H2O （二）材料 小白鼠 三、实验原理

糖元是动物体细胞内贮藏能量的多糖物质，尤其在肝细胞中含量丰富。检测糖元一般采用过碘酸雪夫氏反应（PerioodicAcidSchiffreaction），间称PAS反应。PAS反应的化学基础是利用过碘酸将糖元氧化，使葡萄糖分子中的2，3位碳原子之间的连接键打开，将其上的乙二醇基变为二醛基，醛基与雪夫试剂反应形成紫红色产物而显肝糖元。四、实验步骤（1）切片脱蜡后，经各级浓度酒精下降至蒸馏水（各类切片均可用）。二甲苯I5min→二甲苯II5min→100%乙醇2min→95%乙醇2min→80%2min→70%2 min(2）流水冲洗15一30分钟。(3）0.7%高碘酸溶液处理12分钟。（4）流水洗涤5一10分钟，蒸馏水过一下(5）移入希夫试剂中25-30分钟，避光染色。（6）用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次2分钟。（7）流水洗涤10一15分钟，并通过蒸馏水5分钟。（8）按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。70%乙醇2min→80%2min-95%2min-100%2min→100%2min→二甲苯I5min-→二甲苯II5min→树胶封片。五、实验结果肝糖元染成紫红色的颗粒结构。六、作业1.交PAS反应玻片一张；2.将你的实验结果，绘制成图表示多糖在细胞内的分布

糖元是动物体细胞内贮藏能量的多糖物质，尤其在肝细胞中含量丰富。检测 糖元一般采用过碘酸雪夫氏反应（Perioodic Acid Schiff reaction）,间称 PAS 反应。PAS 反应的化学基础是利用过碘酸将糖元氧化，使葡萄糖分子中的 2，3 位碳原子之间的连接键打开，将其上的乙二醇基变为二醛基，醛基与雪夫试剂反 应形成紫红色产物而显肝糖元。 四、实验步骤 （1）切片脱蜡后，经各级浓度酒精下降至蒸馏水(各类切片均可用)。二甲苯 I 5min →二甲苯 II 5min →100%乙醇 2min→ 95%乙醇 2min→ 80% 2 min→70% 2 min (2) 流水冲洗 15—30 分钟。 (3) 0．7％高碘酸溶液处理 12 分钟。 (4) 流水洗涤 5—10 分钟，蒸馏水过一下 (5) 移入希夫试剂中 25-30 分钟，避光染色。 (6) 用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次 2 分钟。 (7) 流水洗涤 10—15 分钟，并通过蒸馏水 5 分钟。 (8) 按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。70% 乙醇 2min→80% 2min→95% 2min→100% 2min→100% 2min→二甲苯 I 5min →二甲苯 II 5min →树胶封片。 五、实验结果 肝糖元染成紫红色的颗粒结构。 六、作 业 1．交 PAS 反应玻片一张； 2．将你的实验结果，绘制成图表示多糖在细胞内的分布

实验三血涂片的制备技术及血细胞的观察（2学时）瑞氏染色步骤1.取抗凝血液一滴，涂片、自然干燥。2.滴加瑞氏染液染1分钟，染液需覆盖涂片，使标本被其中甲醛所固定3.加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液（或超纯水）轻轻晃动玻片，均匀静置5分钟。4．勿倾倒染液，直接水洗、吸干、镜检

实验三 血涂片的制备技术及血细胞的观察（2 学时） 瑞氏染色步骤 1. 取抗凝血液一滴，涂片、自然干燥。 2. 滴加瑞氏染液染 1 分钟，染液需覆盖涂片，使标本被其中甲醛所固定 3. 加等量 PH6.4 的磷酸盐缓冲液(或超纯水)轻轻晃动玻片，均匀静置 5 分钟。 4. 勿倾倒染液，直接水洗、吸干、镜检