复旦大学：《综合性药学实验》课程教学资源（实验课件）综合实验生物合成实验（人源过氧化氢酶的检测）

实验四人源过氧化氨酶的检测 实验目的 1、掌握酵母发酵液涂片和显微镜镜检的操作技术 2、掌握斑点杂交法(Dotb1ot)鉴定人源过氧化氢酶的方法 3、掌握钼酸铵法检测过氧化氢酶活性的原理和操作

实验四 人源过氧化氢酶的检测 实验目的 1、掌握酵母发酵液涂片和显微镜镜检的操作技术 2、掌握斑点杂交法（Dot blot）鉴定人源过氧化氢酶的方法 3、掌握钼酸铵法检测过氧化氢酶活性的原理和操作

实验材料 ▣ 过氧化氢酶标准品(1000U/mL)和待测样品 Dot blot:过氧化氢酶抗体(Mouse monoclonal antibody)、 辣根过氧化物酶标记二抗(Goat anti-mouse IgG HRP)、 a-萘酚 钼酸铵法：过氧化氢、硫酸、柠檬酸、钼酸铵、PBS 口NC膜、EP管、96孔板、移夜器 ▣ 显微镜、酶标仪、脱色摇床

实验材料  过氧化氢酶标准品（1000U/mL）和待测样品  Dot blot: 过氧化氢酶抗体（Mouse monoclonal antibody）、 辣根过氧化物酶标记二抗(Goat anti-mouse IgG HRP)、 α -萘酚 钼酸铵法: 过氧化氢、硫酸、柠檬酸、钼酸铵、PBS  NC膜、EP管、96孔板、移夜器  显微镜、酶标仪、脱色摇床

发酵液涂片镜检 吸取发酵液，滴一小 滴于载玻片上 火焰上烘干 小水流冲洗 显微镜下观察： 1.有无杂菌污染； 覆上盖玻片 再次烘干 2.酵母形态，并找到出芽生 殖中的酵母

发酵液涂片镜检 吸取发酵液，滴一小 滴于载玻片上 火焰上烘干 小水流冲洗 覆上盖玻片 再次烘干 显微镜下观察： 1. 有无杂菌污染； 2. 酵母形态，并找到出芽生 殖中的酵母

细菌污染 发酵液镜检： 有无杂菌污染 霉菌污染 正常状态

发酵液镜检: 有无杂菌污染 正常状态 细菌污染 霉菌污染

酵母出芽生殖 发酵液镜检结果 酵母 (出芽生殖) 609 手机拍摄 ×400

发酵液镜检结果 酵母 （出芽生殖） ×400 手机拍摄 酵母出芽生殖

显微镜的使用 镜 10× 20×) 100X 40X 10X 物镜(10×，40×， 100×) 载物台 准焦螺旋 光源 显微镜的放大倍数 =目镜倍数×物镜倍数

显微镜的使用 目镜 （10×，20×） 物镜（10×，40×， 100× ） 载物台 准焦螺旋 光源 100X 40X 10X 显微镜的放大倍数 =目镜倍数×物镜倍数

Substrate 斑点杂交原理 Target protein Nitrocellulose filter membrane Primary antibody Secondary antibody conjugate conjugate

斑点杂交原理 Target protein Primary antibody conjugate Nitrocellulose filter membrane Substrate Secondary antibody conjugate

待测 空白 标准品 点样顺序 样品 斑点杂交操作步骤 待测 空白 标准品 样品 样品点样于C膜 4μL,室温放置约 加入封阻液2mL, 吸去封阻液，洗涤 30分钟，待样品完 摇床摆动，封闭6 液2mL洗膜3分钟 全吸收 分钟 ×3次 加CAT抗体液 吸去抗体液，洗涤 加HRP标记二抗液 0.75mL,室温摆 液2mL洗膜3分钟 0.75mL,室温摆 动孵育60分钟 ×3次 动孵育30分钟 吸去二抗液， 洗涤液2mL 加底物液1支（约 用水漂洗终止反应 1mL)显色 洗膜3分钟×3次

斑点杂交操作步骤 样品点样于NC膜 4μL，室温放置约 30分钟，待样品完 全吸收 加入封阻液2mL， 摇床摆动，封闭6 分钟 吸去封阻液，洗涤 液2mL洗膜3分钟 ×3次 加CAT抗体液 0.75mL，室温摆 动孵育60分钟 吸去抗体液，洗涤 液2mL洗膜3分钟 ×3次 加HRP标记二抗液 0.75mL，室温摆 动孵育30分钟 吸去二抗液， 洗涤液2mL 洗膜3分钟 ×3次 加底物液1支（约 1mL）显色 用水漂洗终止反应 点样顺序

斑点杂交显色图片 T 空白 标准品 待测样品

斑点杂交显色图片 空白 标准品 待测样品

细酸铵法检测过氧化氢酶的原理 过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水，放出氧气， 经一定时间反应后，通过测定体系中剩余的过氧化氢 量就可以间接测得过氧化氢酶的活性大小。 过氧化氢可与钼酸铵反应，生成稳定的黄色复合物 (H2Mo04XH2O)n,其颜色深浅与体系中剩余过 氧化氢量成正比，因此通过测定吸光值，就得到剩余 过氧化氢的量，从而计算出过氧化氢酶的活性

钼酸铵法检测过氧化氢酶的原理 过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水，放出氧气， 经一定时间反应后，通过测定体系中剩余的过氧化氢 量就可以间接测得过氧化氢酶的活性大小。 过氧化氢可与钼酸铵反应，生成稳定的黄色复合物 （H2MoO4·XH2O）n ，其颜色深浅与体系中剩余过 氧化氢量成正比，因此通过测定吸光值，就得到剩余 过氧化氢的量，从而计算出过氧化氢酶的活性