复旦大学：《综合性药学实验》课程教学资源（实验课件）综合实验生物合成实验（人源过氧化氢酶的生物合成）

综合性药学实验 生物话性大分子 人源过氧化氢酶的生物合成 Stereo view of the catalase tetramer

综合性药学实验 生物活性大分子 人源过氧化氢酶的生物合成 Stereo view of the catalase tetramer

生物技术药物的定义及发展 是指采用DNA重组技术或其他生物新技术生产的治疗药物，其实质是利 用现代生物技术制备其他方法难以获得的生物活性物质，如多肽、蛋白 质、核酸及其衍生物。 Therapeutic biologics approved by FDA in 1984~2014 Drug category Approvals mAbs 48(38.40%) Enzymes 19(15.20%) 招云分888云6的 Interferon 12(9.60% 1982年世界首个基因工程药物-重组 Fusion proteins 8(6.40%) 人胰岛素上市，商品名Humulin Colony stimulating factor 8(6.40%) Hormones 8(6.40%) 用重组 Growth factors 5(4.00%) Peptides 5(4.00%) Cytotoxins 5(4.00%) Anticoagulants 5(4.00%) 1989年我国首个基因工程药物-重组 Interleukin 2(1.60%) 人干扰素批准投产 Total 125

生物技术药物的定义及发展 是指采用DNA重组技术或其他生物新技术生产的治疗药物，其实质是利 用现代生物技术制备其他方法难以获得的生物活性物质，如多肽、蛋白 质、核酸及其衍生物。 Therapeutic biologics approved by FDA in 1984 ～ 2014 Drug category Approvals mAbs 48(38.40%) Enzymes 19(15.20%) Interferon 12(9.60% Fusion proteins 8(6.40%) Colony stimulating factor 8(6.40%) Hormones 8(6.40%) Growth factors 5(4.00%) Peptides 5(4.00%) Cytotoxins 5(4.00%) Anticoagulants 5(4.00%) Interleukin 2(1.60%) Total 125 1982年世界首个基因工程药物-重组 人胰岛素上市，商品名Humulin 1989年我国首个基因工程药物-重组 人干扰素批准投产

基因工程制药的基本过程 实验一过氧化氢酶基因的获取 获取目的基因 构建重组质粒 上游阶段 实脸二过氧化氧酶重组菌株的构建 构建基因工程菌或细胞 实验三过氧化氨酶的发酵表达 基因工程菌或细胞培养 产物分离纯化 实验四过氧化氩酶的检测 产品检定 下游阶段 制剂制备，包装

基因工程制药的基本过程 产物分离纯化 产品检定 制剂制备，包装 获取目的基因 构建重组质粒 构建基因工程菌或细胞 基因工程菌或细胞培养 上 游 阶 段 下 游 阶 段 实验一 过氧化氢酶基因的获取 实验二 过氧化氢酶重组菌株的构建 实验三 过氧化氢酶的发酵表达 实验四 过氧化氢酶的检测

课程目标 口熟悉基因工程技术合成人源过氧化氢酶的主 要步骤，了解基因工程制备蛋白类药物的基 本过程 口握基因工程常用的实验操作 (核酸提取、PCR扩增、载体连接、转化、阳性重组 菌筛选、凝胶电泳、摇瓶发酵、酶活测定、蛋白杂 交Dot blot等)

课程目标  熟悉基因工程技术合成人源过氧化氢酶的主 要步骤，了解基因工程制备蛋白类药物的基 本过程  掌握基因工程常用的实验操作 (核酸提取、PCR扩增、载体连接、转化、阳性重组 菌筛选、凝胶电泳、摇瓶发酵、酶活测定、蛋白杂 交Dot blot等)

过氧化氢酶简介 过氧化氢酶(catalase,cAT)是广泛存在于生物体内的 一种抗氧化酶，能高效的催化过氧化氢生成分子氧和水。 ▣ 催化特性 ■2H202>2H20+02 口分布 ■所有的动植物 ■几乎所有的需氧微生物 极少量的厌氧微生物

过氧化氢酶简介  过氧化氢酶（catalase，CAT）是广泛存在于生物体内的 一种抗氧化酶，能高效的催化过氧化氢生成分子氧和水。  催化特性  2 H2O2 2 H2O + O2  分布  所有的动植物  几乎所有的需氧微生物  极少量的厌氧微生物

过氧化氢酶的生理作用及医学用途 ▣H,O,是机体中重要的一种活性氧(reactive oxygen species,ROS) Aging Cancer Inflammation ROS Ulcer Cardiovascular diseases 口过氧化氢酶清除H,O,→防止氧化损伤，抗衰老，缓解疾病

过氧化氢酶的生理作用及医学用途  H2O2是机体中重要的一种活性氧 (reactive oxygen species, ROS)  过氧化氢酶清除H2O2 防止氧化损伤，抗衰老，缓解疾病 ROS Cardiovascular diseases …….. Aging Cancer Ulcer Inflammation

人源过氧化氢酶的生产 ■从人血液中提取 来源稀少，成本高，易受病毒等污染，影响安全性 基因工程表达：酵母、大肠杆菌、哺乳动物 细胞等 口毕氏酵母表达系统 ■最简单的真核微生物 ■最常用的真核蛋白表达系统，有效地表达话性蛋白 ■产物胞外分泌

人源过氧化氢酶的生产  从人血液中提取 来源稀少，成本高，易受病毒等污染，影响安全性  基因工程表达：酵母、大肠杆菌、哺乳动物 细胞等  毕氏酵母表达系统  最简单的真核微生物  最常用的真核蛋白表达系统，有效地表达活性蛋白  产物胞外分泌

实验一 人源过氧化氢酶基因的获取 实验目的 ▣ 学习掌握TRIZOL法提取细胞RNA的方法 ▣ 了解使用PCR仪进行RNA反转录及扩增目的基因的方法 反转录 特异引物 RNA CDNA 目的基因 PCR扩增

实验一 人源过氧化氢酶基因的获取 实验目的  学习掌握TRIZOL法提取细胞RNA的方法  了解使用PCR仪进行RNA反转录及扩增目的基因的方法 RNA cDNA 目的基因 反转录 特异引物 PCR扩增

实验材料 ▣ 人肝细胞HepG2 RNA提取试剂：TRIZOL试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇 反转录试剂：Takara PrimeScript®RT Master Mix PCR试剂：Tag PCR Mix、DNA引物 口移夜器、EP管、PCR管、Tips(无菌，DNA/RNAse free) 口PCR仪、高速离心机

实验材料  人肝细胞HepG2  RNA提取试剂: TRIZOL试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇 反转录试剂: Takara PrimeScript® RT Master Mix PCR试剂: Taq PCR Mix、DNA引物  移夜器、EP管、PCR管、Tips（无菌，DNA/RNAse free）  PCR仪、高速离心机

TRIZOL法提取细胞RNA的原理 TRIZOL试剂是一种新型总RNA抽提试剂，可保持RNA的完整性， 同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水 相和有机相，RNA存在于水相。水相中的RNA通过异丙醇沉淀回收。 成分 作用 苯酚 裂解细胞，使细胞中的蛋白变性，核酸物质解聚得到释放。 异硫氰酸胍 强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，同时也使 RNase变性。 8-羟基喹啉 氯仿联合使用可增强对RNasel的抑制。 阝-巯基乙醇 破坏RNase蛋白质中的二硫键

TRIZOL法提取细胞RNA的原理 TRIZOL试剂是一种新型总RNA抽提试剂，可保持RNA的完整性， 同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水 相和有机相，RNA存在于水相。水相中的RNA通过异丙醇沉淀回收。 成分 作用 苯酚 裂解细胞，使细胞中的蛋白变性，核酸物质解聚得到释放。 异硫氰酸胍 强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，同时也使 RNase变性。 8-羟基喹啉 氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。 β-巯基乙醇 破坏RNase蛋白质中的二硫键