复旦大学：《综合性药学实验》课程教学资源（实验课件）综合实验生物合成实验（人源过氧化氢酶的表达）

实验三人源过氧化氢酶的表达 实验且的 口掌握摇瓶发酵的基本实验操作（培养基配制、灭菌和 接种等) 口了解实验室发酵设备和发酵的基本过程

实验三 人源过氧化氢酶的表达 实验目的  掌握摇瓶发酵的基本实验操作（培养基配制、灭菌和 接种等）  了解实验室发酵设备和发酵的基本过程

目的基因的表达 摇瓶培养 小型发酵罐培养 简便、实用，可以在有限的空间、 罐体设计合理，机械搅拌使培养 时间和人力条件下，短时期内获得 基和空气混合接触，溶氧供应能 大量的数据，广泛用于工业微生物 力强，可实时监测数据和取样， 菌种筛选、发酵条件优化、种子培 进行精细控制（温度、pH、溶氧、 养等 补料)，发酵水平高 无法控制溶氧，无法实时取样和检 设备价格昂贵，操控相对复杂 测数据，无法准确补料，无法使用 大接种量，发酵水平相对低

目的基因的表达 摇瓶培养 小型发酵罐培养 简便、实用，可以在有限的空间、 时间和人力条件下，短时期内获得 大量的数据，广泛用于工业微生物 菌种筛选、发酵条件优化、种子培 养等 罐体设计合理，机械搅拌使培养 基和空气混合接触，溶氧供应能 力强，可实时监测数据和取样， 进行精细控制(温度、pH、溶氧、 补料），发酵水平高 无法控制溶氧，无法实时取样和检 测数据，无法准确补料，无法使用 大接种量，发酵水平相对低 设备价格昂贵，操控相对复杂

发酵过程 ·成长期（甘油培养阶段)：该阶段以甘油为碳源， 主要目的是收获一定的菌量。 ·诱导期（甲醇诱导阶段)：在发酵液中流加甲醇 诱导重组蛋白的表达。 重组外源基因上游带有醇氧化酶-1(AOX1)启动子，AOX1启动子受 到甲醇诱导后就能够开放在其后面的目的基因转录成为RNA,再 翻译出蛋白质。 pUC origin 5'AOX1 promoter pPICZa A-rhCA zeocin( 567bp rhCAT gene A0X11

• 成长期（甘油培养阶段）:该阶段以甘油为碳源， 主要目的是收获一定的菌量。 • 诱导期（甲醇诱导阶段）：在发酵液中流加甲醇 诱导重组蛋白的表达。 发酵过程 重组外源基因上游带有 醇氧化酶-1(AOX1)启动子, AOX1启动子受 到甲醇诱导后就能够开放在其后面的 目的基因 转录成为mRNA，再 翻译出蛋白质

实验材抖 ▣ 实验菌种：人源过氧化氢酶重组毕氏酵母菌 ▣ BMMY诱导发酵培养基 蛋白胨 酵母粉 YNB(yeast Nitrogen Base without Amino Acids,无氨基酵母氮源) 磷酸盐缓冲液(KH,PO4、K,HPO) 甲醇 ▣ 三角烧瓶、纱布 ▣ 消毒锅、恒温旋转摇床

实验材料  实验菌种：人源过氧化氢酶重组毕氏酵母菌  BMMY诱导发酵培养基 蛋白胨 酵母粉 YNB（yeast Nitrogen Base without Amino Acids，无氨基酵母氮源） 磷酸盐缓冲液（KH2PO4、K2HPO4) 甲醇  三角烧瓶、纱布  消毒锅、恒温旋转摇床

实验步豫 1. 配制BMY诱导发酵培养基（两组同学合配一份） 蛋白胨 1.8g 小烧杯内称取 酵母粉 0.9g YNB 0.6g 加1M磷酸盐缓冲液9mL,纯水81mL 搅拌均匀，加热溶解（微波炉加热1分钟左右）

实验步骤 1. 配制BMMY诱导发酵培养基 (两组同学合配一份) 蛋白胨 1.8g 小烧杯内称取 酵母粉 0.9g YNB 0.6g 加 1M 磷酸盐缓冲液 9mL ，纯水 81mL 搅拌均匀，加热溶解 (微波炉加热1分钟左右)

实验步骤 2.分装至两个250mL三角烧瓶，40mL/瓶，用摇瓶纱布和报纸 纸封扎瓶口。 报纸 摇瓶纱布 摇瓶绳结

实验步骤 2. 分装至两个250mL三角烧瓶， 40mL/瓶，用摇瓶纱布和报纸 纸封扎瓶口

实验步骤 3.高压蒸汽灭菌（121℃高温灭菌25分钟)。 4.每瓶培养基中加入0.4mL甲醇，再接入重组毕氏酵母1支 (在净化工作台中操作)。 5.培养瓶置摇床旋转培养，30℃，250rpm,每24小时 补0.4mL的甲醇，共三天

实验步骤 3. 高压蒸汽灭菌（121℃高温灭菌25分钟）。 4. 每瓶培养基中加入0.4mL甲醇，再接入重组毕氏酵母1支 （在净化工作台中操作）。 5. 培养瓶置摇床旋转培养，30℃，250rpm，每24小 时 补0.4mL 的甲醇，共三天